序論：好文章的創(chuàng)作是一個不斷探索和完善的過程，我們?yōu)槟扑]十篇基因組學(xué)方法范例，希望它們能助您一臂之力，提升您的閱讀品質(zhì)，帶來更深刻的閱讀感受。

篇（1）

中圖分類號：B842 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-026X（2014）01-0000-01

1.引言

以往英文詞匯記憶策略的研究，不外乎兩個出發(fā)點(diǎn)：―是以英文單詞的結(jié)構(gòu)為出發(fā)點(diǎn)，一是以英文單詞的語境為出發(fā)點(diǎn)。以英文單詞的結(jié)構(gòu)為出發(fā)點(diǎn)，英文詞匯的記憶策略大致包括；機(jī)械復(fù)述策略，漢字?jǐn)M音策略，構(gòu)詞解析策略和意義加工策略。以英文單詞的語境為出發(fā)點(diǎn)，英文詞匯的記憶策略主要包括語境法。

雖然漢字?jǐn)M音策略、構(gòu)詞解析策略、意義加工策略較機(jī)械記憶法在記憶效率上有很大提高，但歸根結(jié)底仍是一種外顯學(xué)習(xí)，即一種有意識的記憶，需要學(xué)生付出較多的注意力。在繁復(fù)的記憶任務(wù)面前，學(xué)生的學(xué)習(xí)積極性能保持多久呢？形成的表象或語句聯(lián)想雖然能啟動音義關(guān)系或形義關(guān)系，但這種關(guān)系能否保持得牢固和長久呢？

2.理論研究

內(nèi)隱學(xué)習(xí)和外顯學(xué)習(xí)之間既有區(qū)別，也有著聯(lián)系。雖然在內(nèi)隱學(xué)習(xí)研究的早期，人們從實(shí)驗(yàn)邏輯上習(xí)慣于將內(nèi)隱學(xué)習(xí)看作和外顯學(xué)習(xí)完全獨(dú)立的全新系統(tǒng)，但實(shí)驗(yàn)室研究表明內(nèi)隱學(xué)習(xí)和外顯學(xué)習(xí)在絕大多數(shù)情況下是混雜在―起的，有機(jī)結(jié)合的。大部分學(xué)習(xí)任務(wù)既包含了外顯學(xué)習(xí)，也包含了內(nèi)隱學(xué)習(xí)。

就內(nèi)隱和外顯學(xué)習(xí)的關(guān)系而言，研究表明了兩者的相互作用。其產(chǎn)生的內(nèi)在機(jī)制是內(nèi)隱學(xué)習(xí)的抽象性，外在條件是外顯學(xué)習(xí)的適時配合。由此推論，學(xué)習(xí)復(fù)雜任務(wù)時應(yīng)先具備一個內(nèi)隱知識基礎(chǔ)，然后再試圖建立外顯的任務(wù)模型。

內(nèi)隱學(xué)習(xí)和外顯學(xué)習(xí)是兩個對立的概念，因此當(dāng)內(nèi)隱學(xué)習(xí)提出之后，早期研究者都更加注重內(nèi)隱學(xué)習(xí)和外顯學(xué)習(xí)之間的區(qū)別，總希望通過純粹有效的分離手段論證內(nèi)隱學(xué)習(xí)的絕對獨(dú)立性。就像Lewicki（1986）曾提出的，內(nèi)隱獲得的知識完全獨(dú)立于外顯知識。Reber（1976）和Broadbent（1988）也強(qiáng)調(diào)兩種學(xué)習(xí)的獨(dú)立性。然而隨著內(nèi)隱學(xué)習(xí)概念本身的不斷成熟和發(fā)展，研究者勢必要考慮到內(nèi)隱和外顯兩種學(xué)習(xí)同時處在學(xué)習(xí)過程的大范疇下，更重要的是它們畢竟同時整合在同一個有機(jī)體――人類的適應(yīng)行為中。因此，內(nèi)隱學(xué)習(xí)和外顯學(xué)習(xí)不應(yīng)只有區(qū)別而沒有聯(lián)系，它們之間的關(guān)系不可能絕對獨(dú)立，而應(yīng)該是相對對立又有著相互作用的。

理解內(nèi)隱學(xué)習(xí)和外顯學(xué)習(xí)之間存在的相互作用，不僅有助于我們從理論上更好地貼近人類學(xué)習(xí)過程的復(fù)雜本質(zhì)，也同時具有實(shí)踐的意義。

3.實(shí)驗(yàn)研究

3.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：本實(shí)驗(yàn)為2×2混合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。自變量為學(xué)習(xí)方式和材料難度。學(xué)習(xí)方式為被試間自變量，有外顯和內(nèi)隱與外顯相結(jié)合兩個水平；材料難度為被試內(nèi)自變量，有難度低和難度高兩個水平：因變量為被試記憶保持量，記憶保持量以自由回憶測試為主。

3.2被試

被試為武漢外語外事職業(yè)學(xué)院2011級的學(xué)生120人。所有被試都是自愿加入，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后可獲得本課程部分平時成績。把他們隨機(jī)分為A、B、C三組（每組40人），分別學(xué)習(xí)諧音記憶材料、會意記憶材料和詞根詞綴記憶材料；再將A、B、C組分別平均分為A1、A2組，Bl、B2組，C1、C2組（每組20人），作為外顯組和結(jié)合組。

3.3實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)使用的材料分為3類：一類為諧音記憶材料（漢字?jǐn)M音材料）；―類為會意記憶材料（意義加工材料）；一類為詞綴記憶材料（構(gòu)詞解析材料）。三類材料分為三個實(shí)驗(yàn)，被試數(shù)量相同，分別同時進(jìn)行。

實(shí)驗(yàn)材料皆選自GRE詞匯表，且經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)證聰該實(shí)驗(yàn)材料對于被試來說皆為生詞。每份學(xué)習(xí)材料包括50個生詞，只計(jì)算中間40個生詞的回憶成績，前20個為較簡單的生詞，后20個為較難的生詞，隨機(jī)排列。

3.4實(shí)驗(yàn)過程

實(shí)驗(yàn)按照以下程序進(jìn)行：告訴結(jié)合組被試他們要參加一個英語單詞記憶測試，他們會先看到一些有關(guān)該單詞拼寫的提示；然后他們會看到該單詞的助記聯(lián)想和該單詞中文意思的漢語拼音和顛倒詞。他們的任務(wù)是根據(jù)以上這些提示生成該單詞的正確拼寫及其中文意思。要求被試把答案寫在學(xué)習(xí)手冊上。被試每過10秒就必須翻頁。在所有刺激呈現(xiàn)完畢后，進(jìn)行10分鐘的自由回憶測試；接著進(jìn)行10分鐘的詞干線索回憶。最后，進(jìn)行10分鐘的中文線索回憶，以詞干線索回憶中的詞干為線索，要求被試進(jìn)行回想，將對應(yīng)的中文意思寫出。告訴外顯組被試他們要參加一個英語單詞記憶測試，他們會看到英文單詞及其中文意思，他們也會看到一些有關(guān)該單詞的助記提示，比如與某詞諧音，像形等等，不要求被試自己生成單詞和中文意思；在所有刺激呈現(xiàn)完畢后，進(jìn)行自由回憶。

3.5統(tǒng)計(jì)方法

用Excel對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

外顯組和結(jié)合組學(xué)習(xí)了諧音材料后，進(jìn)行自由回憶測驗(yàn)，回憶出一個完整英文拼寫得1分，回憶出一個中文得1分，能將相應(yīng)的中文與莢文對應(yīng)起來得1分。

4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)論

在自由回憶測試中，學(xué)習(xí)方式和材料難度的交互作用顯著。具體而言，學(xué)習(xí)難度高的材料；外顯與內(nèi)隱相結(jié)合的學(xué)習(xí)方式與外顯的學(xué)習(xí)方式差別不大，外顯與內(nèi)隱相結(jié)合的學(xué)習(xí)方式?jīng)]有體現(xiàn)出優(yōu)勢；學(xué)習(xí)難度低的材料，外顯與內(nèi)隱相結(jié)合的學(xué)習(xí)方式較外顯的學(xué)習(xí)方式效率高。

實(shí)驗(yàn)證明內(nèi)隱學(xué)習(xí)與外顯學(xué)習(xí)相結(jié)合的學(xué)習(xí)方式是一種高效的單詞學(xué)習(xí)方式。

參考文獻(xiàn)：

篇（2）

20世紀(jì)末，隨著以“中華文化為母語的音樂教育”①口號的提出，越來越多的學(xué)者開始把關(guān)注點(diǎn)放在對中國傳統(tǒng)音樂文化自身的繼承與發(fā)展上面。而少數(shù)民族地區(qū)因其獨(dú)特的人文風(fēng)情，擁有著豐富的民族音樂文化資源，這些已然成為少數(shù)民族地區(qū)學(xué)校音樂教育的關(guān)注點(diǎn)，但是少數(shù)民族地區(qū)一般都是經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)的貧困地區(qū)，教育資源相對貧乏，尤其是在音樂教育方面，普遍存在著師資力量薄弱、教學(xué)設(shè)施匱乏、教育理念落后等現(xiàn)象。

一、當(dāng)前少數(shù)民族地區(qū)學(xué)校音樂教育的現(xiàn)狀

由于經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)，桑植地區(qū)現(xiàn)今仍屬處于國家標(biāo)準(zhǔn)之下的貧困縣范疇。由此，在學(xué)校音樂教育中所體現(xiàn)出的問題尤為突出。

（一）教學(xué)資源極度缺乏仍舊是制約學(xué)校音樂教育發(fā)展的重要因素

教師隊(duì)伍薄弱。教師是課堂教學(xué)活動的引導(dǎo)者、參與者，是音樂教學(xué)中不可缺少的部分。然而在桑植一些偏遠(yuǎn)的“老、少、邊、窮”地區(qū)，音樂教師的缺乏仍是制約其學(xué)校音樂教育發(fā)展的重要因素。相較于桑植縣城鎮(zhèn)地區(qū)的音樂教育而言，位于桑植縣偏遠(yuǎn)的鄉(xiāng)村地區(qū)，音樂教師的缺乏是存在的普遍現(xiàn)象。尤其是在一些偏僻的鄉(xiāng)村學(xué)校，音樂教師的崗位常常處于缺乏的狀態(tài)，甚至一些學(xué)校根本就沒有專職的音樂教師，音樂課一般由文化課老師兼任，這種狀況，嚴(yán)重制約了音樂教育的良好開展。

教學(xué)設(shè)備匱乏。教學(xué)設(shè)施包括專門的音樂教室，多媒體設(shè)備，各種樂器，輔助實(shí)施設(shè)施及教材等。其中，最主要的是器材。音樂器材的演繹，是音樂的重要表達(dá)形式，因而教學(xué)設(shè)備對于音樂文化的有效傳播起著十分重要的作用；同時，隨著互聯(lián)網(wǎng)時代的到來，多媒體教學(xué)在現(xiàn)今社會已然成為了不可或缺的一種教學(xué)手段，利用多媒體創(chuàng)設(shè)情境，讓學(xué)生身臨其境的感受音樂并融入到音樂學(xué)習(xí)的文化語境之中去，可以有利于學(xué)生更好的理解音樂文化。而桑植地區(qū)除了極少數(shù)城鎮(zhèn)學(xué)校配置了音樂教學(xué)所必備的相應(yīng)設(shè)備之外，大部分學(xué)校連音樂課所必需的基礎(chǔ)設(shè)施都沒有，甚至于在一些鄉(xiāng)村小學(xué)，每位同學(xué)一本音樂課本都是不具備的，這對于學(xué)生來說，是多么的可悲！

（二）落后的教學(xué)理念是制約當(dāng)前學(xué)校音樂教育發(fā)展的主要因素

首先，應(yīng)試教育背景下忽視了音樂教育的價值。音樂教育對學(xué)生健全人格的塑造，創(chuàng)造力思維能力的培養(yǎng)以及自信心的樹立等方面有著其它學(xué)科所不能替代的作用。但在現(xiàn)行應(yīng)試教育的背景下，在大多數(shù)老師以及家長的思想觀念中，音樂課是可有可無的。特別是在“老少邊窮”地區(qū)的學(xué)校這種情況尤為突出。為了在中考、高考中能夠取得好成績，音樂課時被大量占用的現(xiàn)象實(shí)屬常見。一些教師認(rèn)為對于身處于偏遠(yuǎn)地區(qū)的學(xué)生而言，應(yīng)該把更多的時間用在文化課的學(xué)習(xí)上面，只有學(xué)好文化課，在考試中取得好成績，考出高分?jǐn)?shù)才是學(xué)習(xí)的唯一目標(biāo)。

其次，音樂課缺乏以文化理解為目標(biāo)的教學(xué)范式。長期以來，學(xué)校的音樂教學(xué)過程仍舊以教授音樂基礎(chǔ)知識和音樂基本技能的“雙基”為音樂教學(xué)主要目標(biāo)，甚至是唯一目標(biāo)。而音樂課的教學(xué)模式則為老師給學(xué)生教唱一首歌曲，學(xué)生通過對音符的學(xué)習(xí)而學(xué)會了該首歌曲，音樂課的任務(wù)就算是完成了。而學(xué)生對于歌曲所要表達(dá)的內(nèi)容是什么、歌曲背后所蘊(yùn)含著什么樣的文化全然不知。這種缺少文化背景的音樂教學(xué)，實(shí)際很難達(dá)到音樂教育的目的，也不可能讓學(xué)生真正懂得音樂的內(nèi)涵。

再者，刻板的教學(xué)方式是對音樂教育錯誤認(rèn)識的直接體現(xiàn)。許多老師、家長乃至于學(xué)生，都沒有充分認(rèn)識到音樂教育的重要性，沒有將之作為一門重要的學(xué)科來對待，使得音樂課成為了“純玩課”、“休閑課”、“應(yīng)付課”、“教唱課”。在桑植縣偏遠(yuǎn)的鄉(xiāng)村學(xué)校，此種情況尤為突出，音樂課的上課方式為老師教唱一首歌曲，在教唱的過程中，老師先唱一句，學(xué)生緊跟著學(xué)唱一句，由此刻板循環(huán)，直至學(xué)生學(xué)會為止。整堂課下來，學(xué)生猶如“復(fù)讀機(jī)”一樣，只知道一句一句的重復(fù)老師所唱，一味的機(jī)械式的被動學(xué)習(xí)，而沒有充分的發(fā)揮自己的主觀能動性，其主體地位沒有得到實(shí)現(xiàn)。

二、少數(shù)民族地區(qū)學(xué)校音樂教育的發(fā)展方向

基于以上現(xiàn)象，筆者認(rèn)為，邊遠(yuǎn)落后少數(shù)民族地區(qū)的音樂教育，在發(fā)展中應(yīng)當(dāng)著重從以下幾方面入手。

（一）樹立正確的教育思想，重視音樂教育

音樂是與生命、生活息息相關(guān)的一種藝術(shù)形式，是生命意志的直接表現(xiàn)。音樂生于人心，與人的情感聯(lián)系非常緊密?！胺惨粽?，生人心者也。情動于中，故形于聲。聲成文，謂之音?！雹谌说乃妓?，喜怒哀樂，素質(zhì)修養(yǎng)，都會通過音樂表現(xiàn)出來。因而音樂本身就是人類生活的重要組成部分，沒有哪一個民族不熱愛。再者言之，“致樂以治心者也?！雹垡魳肥巧鐣钪凶顝V泛又最容易為人們接受的文化形態(tài)，也是提高生活質(zhì)量最直接、最有效的手段，對人的思想、人格、情趣等各方面健康成長具有重要意義，必然成為育德啟智和調(diào)節(jié)情感，提高素質(zhì)的重要工具。

（二）創(chuàng)辦特色教學(xué)，將民族音樂納入到音樂教育之中

近年來，在重視、發(fā)揚(yáng)和傳承傳統(tǒng)文化的時代背景中，音樂界“以中華文化為母語”的音樂教育理念，呼吁重視中華傳統(tǒng)音樂文化，使學(xué)生在學(xué)習(xí)音樂的同時能夠理解其所蘊(yùn)含的文化，理解音樂文化成為了音樂學(xué)習(xí)的一個重要方面。筆者認(rèn)為，落實(shí)這一理念，關(guān)鍵在于兩個方面：一是堅(jiān)持傳統(tǒng)樂教理論，堅(jiān)守人格培育、美化生活的方向。今天我們的音樂教育，就應(yīng)當(dāng)采用優(yōu)良的音樂資源引導(dǎo)教育學(xué)生，接受高尚，擁抱正能量，最終走向幸福美好的前景；二是抓住民族音樂的靈魂，將音樂教育扎根于民族傳統(tǒng)文化的沃土之中，中華民族幾千年的文化當(dāng)中，不乏豐富的音樂理論和音樂教育理論，擁有眾多令世界驚嘆的音樂表現(xiàn)形式。

（三）將學(xué)校作為保護(hù)、傳承和弘揚(yáng)本地音樂文化的主渠道

少數(shù)民族是擅長歌舞的民族，其獨(dú)特的民俗風(fēng)情孕育著多姿多彩的音樂文化，桑植縣是一個少數(shù)民族聚居地區(qū)，孕育出了桑植民歌、土家族擺手舞、白族仗鼓舞等多種民間藝術(shù)形態(tài)，但是現(xiàn)今隨著大量年輕人離開村寨外出打工，民族文化難以為繼，大多數(shù)傳承模式都是靠個別年逾古稀的傳承人帶幾個親傳弟子，無法大面積保留和規(guī)?；瘋鞒?，使得一些文化遺產(chǎn)瀕臨滅絕。因此，將本地特色的音樂文化遺產(chǎn)的保護(hù)傳承與學(xué)校音樂教育相結(jié)合，以學(xué)校為依托，利用學(xué)校音樂教育來發(fā)掘傳承本地音樂文化，使學(xué)校成為其宣傳、保護(hù)、傳承的主渠道，對于保護(hù)本地音樂文化是一種行之有效的方式。

現(xiàn)今，隨著多元文化背景下的文化沖擊，越來越多的學(xué)者開始把注意力聚焦在對中國自身傳統(tǒng)文化的繼承與發(fā)展方面，保護(hù)好、發(fā)展好本地的特色文化成為大家普遍關(guān)注的問題，學(xué)校作為文化傳播的主要途徑，理應(yīng)承擔(dān)起傳承民族音樂文化的重任。但是由于受到種種條件的制約，致使現(xiàn)今大多數(shù)少數(shù)民族地區(qū)的學(xué)校音樂教育狀況都不容樂觀，無論是教學(xué)資源，還是教學(xué)理念，都存在一定的問題，這就需要切實(shí)下大力去改善，一方面地方政府應(yīng)當(dāng)加大對少數(shù)民族地區(qū)學(xué)?；A(chǔ)設(shè)施的投入，另一方面組建專門的民族音樂師資隊(duì)伍，更新教育理念，賦予學(xué)校研究、傳承和保護(hù)地方民族音樂文化遺產(chǎn)的責(zé)任。由此，不但可以發(fā)展少數(shù)民族地區(qū)的學(xué)校音樂教育，體現(xiàn)少數(shù)民族地區(qū)學(xué)校音樂教育的鮮明特色，且通過學(xué)校音樂教育的方式來保護(hù)和開發(fā)本地的音樂文化，從而拓寬了保護(hù)傳承的渠道，使得少數(shù)民族地區(qū)的民間音樂文化得以更好的保護(hù)與傳承。

注釋：

①關(guān)新.《中華文化為母語的音樂在京研討會紀(jì)要》，《中國音樂》，1996.2

②王書良等：《論語?秦伯》中國文化精華全集哲學(xué)卷，北京：中國國際廣播出版社，1992：83.

③《禮記?樂記》，北京：北京華文出版社，2009：331.

參考文獻(xiàn)：

[1]謝嘉幸，郁文武.音樂教育與教學(xué)法[M].北京：高等教育出版社，2006.

篇（3）

關(guān)鍵詞:地中海貧血;多重PCR;篩查

Investigation into the methods of screening thalassemia gene in LI Nationality population in Hainan.

Abstract:Objective To find a method that can be used for massively screening of thalassemia gene Li Nationality community. Methods Multiplex-PCR was used for screeningβ-thalassemia carriersβ°CD41/42）and theα 2 gene deficient carriers in a sin-gle reaction. Results Out of the1207Li Nationality samples123thalassemia carriers（accounted for10%）and212completeα 2 gene deficient carriers（including3HbH disease patients）were detected. Conclusion The method is suitable for scredning tha-lassemia gene carriers in Li Nationality population.

Key words:Thalassemia;Multiplex-PCR;Screening

地中海貧血是我國南方常見的一種遺傳性血液病，其共同特點(diǎn)是由于珠蛋白基因缺失或缺陷使血紅蛋白中珠蛋白鏈合成受抑制，導(dǎo)致血紅蛋白成分組成結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，臨床上以慢性進(jìn)行性溶血性貧血為主要表現(xiàn)，輕型可無或僅有輕度貧血，重者有嚴(yán)重貧血、肝脾腫大、生長發(fā)育落后及骨骼改變等，目前除干細(xì)胞移植外尚無其他有效的根治方法。重癥患兒需輸血以維持生命，大部分患兒因輸血并發(fā)癥或嚴(yán)重貧血死于成年之前，嚴(yán)重影響家庭和兒童生活質(zhì)量。海南是地中海貧血高發(fā)區(qū)，尤其在黎族人群中β-地貧的發(fā)生率高達(dá)6%～8% ［1］，且95%以上為β°CD41/42（-TCTT）突變。α-地貧基因攜帶率55.1% ［2］ ，以缺失型多見，而無論α 3.7 或α 4.2 的缺失都與α 2 基因有關(guān)，根據(jù)這些特點(diǎn)，設(shè)計(jì)一種在群中以篩查β°CD41/42（-TCTT）及α 2 基因?yàn)槟康亩嘀豍CR技術(shù)，為海南省黎族人群優(yōu)生工作提供簡易可行的實(shí)驗(yàn)方法。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 在海南6個縣、市五個支系黎族人口選擇并簽署知情同意書的1207人（其中陵水縣343例、白沙縣265例、通什148例、保亭縣343例、東方縣149例、樂東縣144例），各取外周血0.1ml，置于含EDTA10μl在抗凝管中混勻。

1.2 群體篩查 每例標(biāo)本各取抗凝血10μl用于血紅蛋白電泳和紅細(xì)胞脆性試驗(yàn)（按本科室常用方法）。

1.3 DNA提取 取0.1ml抗凝血分離白細(xì)胞，按常規(guī)方法用chelex-100提取DNA樣品 ［3］ 。

1.4 PCR擴(kuò)增

1.4.1 引物設(shè)計(jì) P 1 Gen Bank HumHBA 4 編號7369-7388 5 -GCTGACCTCCAAATACCGTT-3 P 2 Gen Bank HumHBA 4 編號7548-7525 5 -CCATTGTTGGCACATTCCGGGACA-3P 3 Gen Bank HumHBGL 3 編號387-413 5 -TCTACCCTTGGACCCAGAGGTTGA-3P 4 Gen Bank HumBGL 3 編號665-643 5 -TCCTATGACATGAACTTAACCAT-3P 5 Gen Bank HumBGL 3 編號1055-1074 5 -GTGTACACATATTGACCAAA-3 P 6 Gen Bank HumBGL 3 編號1477-1457 5 -AGCACACAGACCAGCACGTT-3

其中P 1 -P 2 為擴(kuò)增α 2 基因引物對，擴(kuò)增片段為180bp，P 3 -P 4 為擴(kuò)增β°CD41/42（-TCTT）引物對，擴(kuò)增片段為275bp，P 5 -P 6 為擴(kuò)增正常β-鏈基因引物對，作為本試驗(yàn)的內(nèi)對照物，擴(kuò)增片段長度423bp。

1.4.2 試劑配制 P 1 -P 2 各3.0μl、P 3 -P 4 各3.0μl、P 5 -P 6 各4.0μl;10mM dNTP10μl;10×Buffer（MBI）50μl;25mMMgCl 2 50μl;雙蒸水300μl;配成反應(yīng)混合液，每管分裝20μl。

1.4.3 反應(yīng)條件 取試劑20μl，樣品3μl，加入MBIE1.0U/μl配劑反應(yīng)混合液94℃預(yù)熱5min，然后94℃30s，55℃40s，72℃45s，32個循環(huán)后，72℃5min延伸。

2 結(jié)果

經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后，結(jié)果顯示正常者只出現(xiàn)兩條區(qū)帶一為α 2 基因的180bp區(qū)帶;一為作為實(shí)驗(yàn)正常對照的β基因的423bp大小的區(qū)帶。若180bp帶缺失為α-地 2 純合子;出現(xiàn)275bp為β°CD41/42的雜合子。見圖1。

圖1 地中海貧血α 2 全缺和β°CD41/42復(fù)合體PCR擴(kuò)增電泳圖（略）

1:α 2 全缺;2、4:正常;3:β41/42雜合子;5、6:α 2 全缺及β41/42復(fù)合體

在1207例樣品中檢出β°CD41/42（-TCTT）攜帶者123例，占10%;檢出α 2 基因全缺212例，占17.6%（其中HbH病例3例），至于是否左側(cè)或右側(cè)缺失再作進(jìn)一步分析（另文討論）。

3 討論

地中海貧血在東南亞及我國南方發(fā)病率非常高，由于不同程度的α珠蛋白基因缺失使其表型各異，臨床表現(xiàn)不同，單個或二個α基因的缺失在臨床上癥狀輕微甚至無任何臨床癥狀及血象改變，故易被漏診。由于中國人中常見的缺失型地貧--α 3.7 、--α 4.2 和-- sea 均與α 2 基因有關(guān) ［2］ ，因此對α 2 基因進(jìn)行篩查，可檢出缺失型HbH、及左側(cè)或右側(cè)缺失型的α-地 2 基因的攜帶者，本方法雖能檢出α-地 2 基因的純合子，結(jié)合電泳圖譜可檢出缺失型HbH患者，但如進(jìn)一步確診尚須鑒定左側(cè)抑或右側(cè)缺失;且本方法雖然未能檢出約5%除基因型為β°CD41/42以外的β-地貧，但可借助Hb電泳、紅細(xì)胞脆性試驗(yàn)及HbA 2 定量，對疑似β-地貧患者進(jìn)一步做斑點(diǎn)雜交法進(jìn)行確診。本篩查法簡便、可靠、經(jīng)濟(jì)易行，用時可采用快速法提取DNA，可在3～4h內(nèi)得到結(jié)果。因此本法適用于β°CD41/42及α-地 2 高發(fā)區(qū)人群基因篩查;對于重型地貧的預(yù)防，提高人口素質(zhì)有重要的意義。

參考文獻(xiàn)

［1］陳洛夫，黃冬愛，文平中，等.95例黎族人地中海貧血基因類型分析［J］.海南大學(xué)學(xué)報(bào)自然科學(xué)版，1993，11（2）:47～49.

篇（4）

1土壤宏基因文庫的構(gòu)建

關(guān)于土壤宏基因組學(xué)技術(shù)的構(gòu)建已有許多研究報(bào)道，文庫的構(gòu)建需要足夠高質(zhì)量的DNA，由于土壤微生物往往會與土壤其他組分緊密結(jié)合，這就增加了提取土壤DNA的難度。常用的方法包括直接提取法和間接提取法。直接提取法是將樣品直接懸浮在裂解緩沖液中處理，使其釋放DNA，繼而抽提純化；間接提取法是首先去除土壤等雜質(zhì)，通過不同的離心速度從土壤中分離出細(xì)胞，然后對細(xì)胞進(jìn)行抽提。直接提取法提取的DN段較?。?~50kb），提取率高，操作簡單；間接提取法提取的片斷較大（20~500kb），純度高，但操作繁瑣，有些微生物在分離過程中會丟失。

根據(jù)插入片斷大小，可以把基因文庫分成2類：質(zhì)粒載體的小片段插入（小于15kb）和柯斯質(zhì)粒（15~40kb）或BAC（細(xì)菌人工染色體）（超過40kb）載體的大片段插入。大腸桿菌（Escherichiacoli）是表達(dá)土壤細(xì)菌基因或基因簇的通用宿主，穿梭載體或BAC文庫可將大腸桿菌包含的文庫信息轉(zhuǎn)移至其他宿主如鏈霉菌或假單胞菌。

載體系統(tǒng)的選擇取決于所提取土壤DNA的質(zhì)量及研究目的，包括欲插入目的片段的大小、所需要的載體拷貝數(shù)、使用的宿主以及篩選方法等。如對腐殖質(zhì)含量較高或剪切較嚴(yán)重的DNA樣品適宜構(gòu)建質(zhì)粒文庫，小片段的文庫適用于篩選新的與代謝相關(guān)的單基因或小操縱子；而對于含較大基因簇或大片段的DNA樣品則需要構(gòu)建大片段和大容量的載體文庫。Rondon直接把環(huán)境DNA克隆到低拷貝BAC載體，以大腸桿菌作為宿主構(gòu)建了含100Mbp的小文庫（SL1），并從這個文庫中檢測到DNA酶、脂肪酶、淀粉水解酶的活性。

2土壤宏基因組文庫的篩選

宏基因文庫的篩選主要有功能驅(qū)動篩選、化合物結(jié)構(gòu)水平的篩選、序列驅(qū)動篩選，底物誘導(dǎo)基因表達(dá)篩選。功能驅(qū)動篩選是根據(jù)重組克隆產(chǎn)生的新活性進(jìn)行篩選，在工業(yè)上有很多重要的酶就是用這種方法發(fā)現(xiàn)的。其主要缺點(diǎn)是要在寄主中進(jìn)行功能表達(dá)，造成篩選工作量大，效率低?；衔锝Y(jié)構(gòu)水平的篩選是根據(jù)不同結(jié)構(gòu)的物質(zhì)在色譜中有不同的峰值，通過比較轉(zhuǎn)入和未轉(zhuǎn)入外源基因的宿主細(xì)胞或發(fā)酵液抽提物的色譜圖篩選產(chǎn)生新結(jié)構(gòu)化合物的克隆子。此方法工作量大，費(fèi)用高。序列驅(qū)動篩選是不依賴重組基因在宿主中表達(dá)來篩選，而是根據(jù)已知功能的基因序列設(shè)計(jì)探針或PCR引物，通過雜交進(jìn)行篩選具有目標(biāo)序列的克隆子。底物誘導(dǎo)基因表達(dá)篩選是利用底物誘導(dǎo)克隆子分解代謝基因進(jìn)行篩選，這種方法已經(jīng)成功的從宏基因中篩選出芳烴化合物誘導(dǎo)的基因。國內(nèi)外的資料顯示這4種篩選方法可以篩選到所需要的物質(zhì)，但篩選效率低，費(fèi)用高。

3土壤宏基因組研究現(xiàn)狀

利用宏基因組學(xué)的技術(shù)，科研人員篩選到了許多功能基因，加拿大TerraGenDiscover公司最先在以鏈霉菌為宿主的宏基因組文庫中篩選到了具有抗菌活性的5種新的小分子物質(zhì)TerragineA、B、C、D、E；Courtois等利用柯斯載體構(gòu)建了含5000個克隆子的環(huán)境基因組文庫，采用PCR序列分析的方法，篩選出編碼聚酮合成酶的新基因，同時采用HPLC技術(shù)發(fā)現(xiàn)了脂肪二烯醇中2種新的化合物，兩者互為同分異構(gòu)體；Yun等選用pUC19為克隆載體構(gòu)建大腸桿菌基因組文庫，利用活性篩選方法，從30000個重組子中篩選出1個含淀粉酶基因（amyM）的克隆子。

2005年，LimHK等以枯草芽孢桿菌為宿主，建立了森林土壤的宏基因組文庫，篩選到2個具有抗菌活性的克隆，對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，得出其中一個為產(chǎn)紅素的靛玉紅，另一個為產(chǎn)藍(lán)素的靛藍(lán)，是靛玉紅的異構(gòu)體。2006年，VogetS等首次研究了從土壤宏基因組文庫中篩選到的一種纖維素酶的性質(zhì)，證實(shí)了其具有較廣的pH值和溫度適應(yīng)范圍，并且在較高的鹽度時也具有活性，具有工業(yè)應(yīng)用價值。

4土壤宏基因組學(xué)的技術(shù)局限性

總DNA提取技術(shù)尚存在一定的限制，土壤環(huán)境中，由于微生物與土壤顆粒緊密結(jié)合的特性以及腐殖酸等抑制性物質(zhì)存在等原因，從中難以獲得適于構(gòu)建宏基因組文庫的高分子量DNA。Bertrand等采用間接提取法，通過Nycodenz梯度離心，所回收的土壤DN段大小己能達(dá)到400kbp，但至今基于原位裂解獲得>100kbp土壤DNA的提取技術(shù)尚未突破，運(yùn)用原位裂解法構(gòu)建更大片段環(huán)境宏基因組文庫（現(xiàn)有的土壤宏基因組文庫中，平均插人片段最大為44.5kb）仍是一個難點(diǎn)。不可避免地，環(huán)境宏基因組文庫所包含微生物基因組信息的偏差將直接導(dǎo)致“基因遺漏”現(xiàn)象發(fā)生，如海洋中普遍存在的微生物固氮基因，卻在測序量高達(dá)1.6Gbp的馬尾藻海水宏基因組文庫中被遺漏，表明僅運(yùn)用宏基因組學(xué)技術(shù)同樣會忽略部分的微生物資源。

篇（5）

人類基因組計(jì)劃的成功實(shí)施與完成標(biāo)志著基因組學(xué)的誕生,她是一門新興起的生命科學(xué)邊緣學(xué)科。以人類基因組測序完成為標(biāo)志,基因組生物學(xué)的研究重點(diǎn)由結(jié)構(gòu)基因組學(xué)轉(zhuǎn)向以蛋白質(zhì)組學(xué)為重要研究領(lǐng)域之一的功能基因組學(xué)。基因組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)研究的實(shí)施與發(fā)展又孕育了生物信息學(xué)這一新興交叉學(xué)科的產(chǎn)生與發(fā)展?；蚪M學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、生物信息學(xué)是基因組生物學(xué)的非常重要的研究領(lǐng)域,它們的發(fā)展息息相關(guān),相輔相成,且與人類起源、疾病(如癌癥、肌營養(yǎng)不良癥、家族遺傳病等)預(yù)測診斷治療、新藥物新疫苗開發(fā)、生物武器鑒定、長壽與衰老死亡等許多方面有著重要關(guān)系,成為當(dāng)今生命科學(xué)的熱點(diǎn)與前沿。廣義上,基因組學(xué)包含了結(jié)構(gòu)基因組學(xué)、功能基因組學(xué)、比較基因組學(xué)、生物信息學(xué)等方面的內(nèi)容。因此,該課程是一門生物學(xué)前沿課程和交叉課程,對于豐富生物技術(shù)等相關(guān)專業(yè)學(xué)生知識面,完善知識結(jié)構(gòu)和提高創(chuàng)新能力都有著重要影響。我就近幾年來關(guān)于基因組學(xué)的教學(xué)實(shí)踐談幾點(diǎn)體會,并對革新課堂教學(xué)模式進(jìn)行了初步嘗試。

一、教材

教材是一門課程的主要教學(xué)參考書,是確保教學(xué)過程系統(tǒng)性、規(guī)范性的關(guān)鍵,對教學(xué)效果有重要影響?；蚪M學(xué)是一門新興起的生命科學(xué)邊緣學(xué)科,我國許多高校的生物技術(shù)等相關(guān)專業(yè)課程設(shè)置中都將其設(shè)為專業(yè)限選課或選修課,如華中農(nóng)業(yè)大學(xué)、天津醫(yī)科大學(xué)、重慶郵電大學(xué)等。本課程也是我校生物技術(shù)專業(yè)的一門專業(yè)限選課。在考察了有關(guān)基因組研究的眾多參考資料和兄弟院校的開課實(shí)際后,我們選了結(jié)構(gòu)體系比較完整、內(nèi)容深淺適宜、覆蓋面較全的復(fù)旦大學(xué)楊金水編著的《基因組學(xué)(第二版)》(高等教育出版社,2007年)為主要教材。此外,選用了袁建剛等翻譯的、BrownTA編著的《基因組2》(科學(xué)出版社,2006年)及其英文版原著Genomes2(BIOS Scientific Publishers Ltd)為重要參考教材。中英文對應(yīng)的參考教材的使用更方便了學(xué)生對專業(yè)名詞的理解和把握,有助于學(xué)生對專業(yè)英文文獻(xiàn)的查閱和利用,便于跟蹤學(xué)科前沿,擴(kuò)充知識面,豐富學(xué)生視野。

二、教學(xué)內(nèi)容

基因組學(xué)是從整體上對生物基因組中所有DNA進(jìn)行測序、拼裝和序列分析的一門科學(xué),其研究對象涉及包括原核生物和真核生物在內(nèi)的所有生命體?；蚪M測序的前提是進(jìn)行基因組作圖,包括遺傳圖譜、物理圖譜、轉(zhuǎn)錄本圖譜制作。測序后核苷酸序列分析主要是進(jìn)行序列闡釋,包括基因預(yù)測、各種類型重復(fù)序列鑒定與功能性MicroRNA的預(yù)測,等等。最后是進(jìn)行各種功能性元件如基因、MicroRNA等功能分析。因此,基因組學(xué)的主要教學(xué)內(nèi)容包括基因組的基本結(jié)構(gòu)及組成,遺傳圖譜與物理圖譜制作,基因組測序,基因組序列解讀,基因組內(nèi)基因的表達(dá)和調(diào)控,染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)與基因表達(dá)調(diào)控,基因組活性的調(diào)控,不同生物基因組比較序列分析,基因組進(jìn)化,等等,并結(jié)合當(dāng)今基因組學(xué)研究的前沿進(jìn)行有選擇性的、重點(diǎn)的專題介紹,使學(xué)生不但能系統(tǒng)學(xué)習(xí)基因組學(xué)的必備知識,而且能對本學(xué)科發(fā)展方向及目前重大研究與突破有所了解,以豐富學(xué)生的相關(guān)知識并拓寬學(xué)生的知識面,為今后的就業(yè)與創(chuàng)業(yè)打下良好的基礎(chǔ)。

三、教學(xué)方法

近年來我國多數(shù)高校本科各專業(yè)培養(yǎng)方案普遍采取的是多課程、少學(xué)時的模式,使多數(shù)課程學(xué)時嚴(yán)重不足[1-2]。就基因組學(xué)課程來講,多數(shù)內(nèi)容是生命科學(xué)研究的前沿與熱點(diǎn),而且對于多數(shù)本科生來說不容易理解和接受,這客觀上需增加學(xué)時進(jìn)行詳細(xì)闡述。一方面教學(xué)大綱規(guī)定的學(xué)時嚴(yán)重不足,而另一方面教學(xué)實(shí)踐上又確實(shí)需要增加學(xué)時來完成“解惑”的任務(wù),怎樣解決這一棘手的矛盾呢?這就需要根據(jù)學(xué)生已經(jīng)學(xué)過的相關(guān)課程,對課程內(nèi)容進(jìn)行精選而且課程骨架知識體系又不被破壞,制定詳細(xì)的教學(xué)計(jì)劃,講課方法根據(jù)內(nèi)容進(jìn)行有針對性選取,教學(xué)手段以多媒體輔助教學(xué)為主,并輔以必要的板書。

我在講課實(shí)踐中采取的是重點(diǎn)內(nèi)容(如基因組作圖與測序、功能基因組學(xué)中的表觀遺傳學(xué)部分、基因組進(jìn)化中的端粒復(fù)制與基因組穩(wěn)定性及基因組進(jìn)化的機(jī)制與模式等)以講授法為主,特別重要的知識點(diǎn)上輔以啟示法、討論法教學(xué),如在講到表觀遺傳學(xué)的座位控制區(qū)LCR(Locus Control Region)功能的內(nèi)容時,我設(shè)計(jì)了圖片(圖1、2),在講解時PPT演示按圖1、2所示分步驟一一顯示的,之后進(jìn)行討論,最后推而廣之――研究一段待測DNA的功能時大都可以采取類似的方法。這樣邊講解、邊啟示、邊討論,最后讓學(xué)生自己總結(jié)出共性的東西的綜合教學(xué)法,極大地提高了學(xué)生課堂參與的積極性、主動性和創(chuàng)造性,取得了很好的教學(xué)效果。期末,學(xué)生的成績較好,而且學(xué)生對教學(xué)效果評價很高,達(dá)到優(yōu)秀等次。

對于基因組學(xué)課程和分子生物學(xué)、生物化學(xué)等相關(guān)課程相交叉的內(nèi)容,則以提問法為主要講課手段,以將知識點(diǎn)前后貫通為主要目標(biāo)進(jìn)行教學(xué),并適當(dāng)加快教學(xué)進(jìn)度。對于一些次要的、擴(kuò)充性內(nèi)容則以課堂講授法為主,點(diǎn)到為止,但要求學(xué)生課下自讀。對于一些最近發(fā)展起來的新技術(shù)、新方法、新領(lǐng)域,則以專題的形式進(jìn)行教學(xué),以1―4學(xué)時的時間為宜,并以國內(nèi)外權(quán)威期刊雜志如《科學(xué)通報(bào)》、《中國農(nóng)業(yè)科學(xué)》、Nature、Science、PNAS、Plant Cell等近幾年尤其是近2年刊登的相關(guān)文章主要教學(xué)參考資料,確保專題教學(xué)的新穎性、權(quán)威性。

四、教學(xué)模式

教學(xué)模式是圍繞教學(xué)目標(biāo)在一定的教育思想指導(dǎo)下形成的相對穩(wěn)定的教學(xué)范型,是人們在長期的教學(xué)實(shí)踐中不斷總結(jié)、改進(jìn)而逐步形成的,對教學(xué)效果有著重要影響。[3]近些年來,隨著新的教育教學(xué)思想不斷涌現(xiàn),以及人們對教育教學(xué)認(rèn)識的不斷深化,許多新的教學(xué)模式產(chǎn)生了,如愉快教學(xué)模式、自學(xué)輔導(dǎo)教學(xué)模式、探究研討教學(xué)模式、主體性教學(xué)模式等。[4]雖然這些教學(xué)模式體現(xiàn)了新時期素質(zhì)教育的要求,但仍拘泥于固定場所的課堂教學(xué)模式。

1969年,美國的神經(jīng)病學(xué)教授Barrows在加拿大的McMaster大學(xué)創(chuàng)立了PBL教學(xué)模式,即以問題為學(xué)習(xí)基礎(chǔ)(Problem-Based Learning,PBL)的教學(xué)模式[5]。PBL教學(xué)模式以具體疾病為基礎(chǔ),緊密結(jié)合臨床實(shí)踐,提倡以學(xué)生為中心、教師為引導(dǎo)的小組討論式教學(xué)。其核心問題由多學(xué)科教學(xué)人員和相關(guān)臨床?？迫藛T共同設(shè)計(jì),建立完善的學(xué)習(xí)模塊,制定出某一病例的PBL手冊,提供給各討論小組。根據(jù)討論的問題與學(xué)習(xí)深度的不同將教學(xué)分為初級、中級、高級三個水平,初級水平的病例為模擬的標(biāo)準(zhǔn)病人(Standard Patient,SP),中高級的病例則為真實(shí)病人(Real Patient,RP)。在教室或醫(yī)院,由教師、學(xué)生、模擬病人(或真實(shí)病人)組成學(xué)習(xí)的虛擬或真實(shí)場景,進(jìn)行三段討論式教學(xué),即提出問題,討論自學(xué)建立假設(shè),討論自學(xué)解疑,論證假設(shè)。每一模塊學(xué)習(xí)結(jié)束后進(jìn)行測試、考核,最后進(jìn)行總評。不難看出,與傳統(tǒng)的知識傳授型教學(xué)模式相比,PBL教學(xué)模式調(diào)動了學(xué)生主動學(xué)習(xí)的積極性,有利于提高學(xué)生的表達(dá)能力、溝通技巧和人際交流能力;有利于培養(yǎng)學(xué)生團(tuán)隊(duì)精神和協(xié)作能力;有利于培養(yǎng)學(xué)生的臨床思維;PBL教學(xué)模式使實(shí)用性知識的傳授更加得到重視;由于評估體系科學(xué),能準(zhǔn)確評估教學(xué)效果。目前,該教學(xué)模式已被世界上許多大學(xué)的醫(yī)學(xué)專業(yè)教育所廣泛采納。

受該教學(xué)模式啟發(fā),我認(rèn)為基因組學(xué)少部分教學(xué)內(nèi)容可以進(jìn)行專題討論式教學(xué)模式探討。具體來講,就是首先與相關(guān)教師一塊兒設(shè)計(jì)每一個專題的核心問題,并提出應(yīng)達(dá)到的目標(biāo)要求,帶到課堂讓學(xué)生討論、發(fā)表意見,確定問題;之后,學(xué)生通過利用圖書館、網(wǎng)絡(luò)、知識講座等進(jìn)行自學(xué)解疑,整理并寫出問題的解決方法,再進(jìn)行課堂交流、討論;最后,通過討論進(jìn)行歸納總結(jié)。當(dāng)通過課堂討論提出核心問題之后,學(xué)生甚至可以分組到相關(guān)實(shí)驗(yàn)室參觀學(xué)習(xí),有條件的可以讓學(xué)生參與部分科研工作,這樣既可以讓學(xué)生將理論與實(shí)踐相結(jié)合,直接接觸前沿課題研究實(shí)際,又可以減輕教師科研中一些簡單的重復(fù)性勞動,提高科研設(shè)備的使用率。

五、結(jié)語

基因組學(xué)是伴隨著人類基因組計(jì)劃而誕生的一門新興學(xué)科,是當(dāng)今生命科學(xué)研究的前沿,與人類重大疾病分子機(jī)理、生物起源演化、新藥物新疫苗開發(fā)等許多重要問題息息相關(guān),對人類社會生活的許多方面都有重要影響。在我國許多高校的生物技術(shù)及其相關(guān)專業(yè)中基因組學(xué)是必開的一門課程,我就近幾年來的基因組學(xué)授課實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行了概括介紹,并就教學(xué)模式創(chuàng)新、改革提出了建議,希望能對兄弟院校相關(guān)專業(yè)學(xué)生的培樣及相關(guān)課程的任課老師有所裨益。

參考文獻(xiàn):

[1]張琛.酶工程課程的教學(xué)方法的探討與體會[J].科教文匯(上旬刊),2009,(1):223.

[2]梁紅波,鐘衛(wèi),熊磊.高分子物理課程的教學(xué)體會[J].高教論壇,2009,(1):80-81.

[3]方展勇.淺論課堂教學(xué)模式[J].廣西教育學(xué)院學(xué)報(bào),2001,(3):35-39.

篇（6）

【中圖分類號】Q781

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

宏基因組學(xué)認(rèn)為，生命研究的對象應(yīng)是生物環(huán)境中全部微小生物的基因組，即特定環(huán)境下所有生物遺傳物質(zhì)的總和。它包含了可培養(yǎng)的和不可培養(yǎng)的微生物的基因總和，微生物主要包括環(huán)境樣品中的細(xì)菌和真菌；因此，宏基因組學(xué)就是一種以環(huán)境樣品中的微生物群體基因組為研究對象，以功能基因篩選和測序分析為研究手段，以微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、功能活性、相互協(xié)作關(guān)系以及與環(huán)境之間的關(guān)系等為研究目的的新的微生物群落研究方法，也稱為微生物環(huán)境基因組學(xué)、元基因組學(xué)或生態(tài)基因組學(xué)。

利用宏基因組學(xué)技術(shù)研究口腔微生物，無需單一分離培養(yǎng)某一種類的微生物，即可直接在基因水平上研究口腔微生物，包括可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)微生物。宏基因組學(xué)應(yīng)用于口腔微生物的研究，主要包括兩個方面：一方面進(jìn)行微生物生態(tài)學(xué)研究，從整體微生物群落水平來研究口腔微生物，揭示口腔微生物群落多樣性及其變化；另一方面是進(jìn)行口腔微生物及其基因的研究，從中篩選到新的功能基因及其產(chǎn)物。通過這兩方面的研究，較全面地了解口腔微生物的群落結(jié)構(gòu)和功能基因組，為深入探索口腔微生物的代謝活動，最大限度地發(fā)掘口腔微生物資源提供可能。

1　宏基因組學(xué)的研究方法

宏基因組學(xué)是從特定環(huán)境中直接分離所有微生物的DNA，選擇合適的載體用于克隆DN段，將DN段克隆到宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，根據(jù)某些生物活或基因序列篩選有價值的克隆并進(jìn)行其功能分析。

1.1宏基因組文庫的構(gòu)建

1.1.1環(huán)境微生物DNA的提取　環(huán)境樣品DNA的提取是基因組文庫構(gòu)建中最重要的一步，不僅要盡可能地將環(huán)境中所有微生物的DNA提取出來，而且還要保證一定的DN段長度和完整性。根據(jù)提取樣品總DNA前是否需要分離細(xì)胞，可將其提取方法分為原位裂解法和異位裂解法。原位裂解法可直接破碎樣品中的微生物細(xì)胞而使其DNA得以釋放。原位裂解法無需對樣品微生物進(jìn)行復(fù)蘇，黏附顆粒上的微生物細(xì)胞亦能被裂解，所得DNA能更好地代表微生物的多樣性。由于原位裂解法所提取的DN段僅為1～50kb，故其通常用于構(gòu)建小片段插入文庫（以質(zhì)?；蛉胧删w為載體）的DNA提取。異位裂解法則先采用物理方法將微生物從樣品中分離出來，然后以較溫和的方法抽提其DNA。此法提取可以獲得長度為20～500kb的大片段DNA，而且純度高，但卻容易丟失微生物物種信息。該方法適用于構(gòu)建大片段插入文庫（以黏?；蚣?xì)菌人工載體為載體）的DNA提取。

1.1.2載體選擇　目的基因能否有效地轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞并在其中高表達(dá)，在很大程度上取決于載體。通常用于DNA克隆的載體包括質(zhì)粒、黏粒和細(xì)菌人工染色體（bacterial　artificial　chromosome，BAC）等。質(zhì)粒一般用于克隆小于10kb的DN段，適用于單基因的克隆與表達(dá)。黏粒又稱柯斯質(zhì)粒或柯斯載體，用于克隆大片段的DNA分子，其克隆外源DN段的極限高達(dá)350kb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過質(zhì)粒載體的克隆能力。BAC用于克隆150kb左右大小的DN段，最多可保存300kb個堿基對，轉(zhuǎn)化率高，而且其以環(huán)狀結(jié)構(gòu)存在于細(xì)菌體內(nèi)，易于分辨和分離純化。另外，構(gòu)建能容納40kb外源DNA插入片段的fosmid文庫也有報(bào)道。

1.1.3宿主選擇　目前，常用的宿主主要有大腸埃希菌以及鏈霉菌屬或假單胞菌屬。一些缺陷型突變體細(xì)菌也可以作為宿主進(jìn)行宏基因組文庫的功能篩選。宿主的選擇主要應(yīng)考慮其轉(zhuǎn)化率和宏基因表達(dá)以及重組載體在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定性和目標(biāo)性狀的篩選等。對于任何宏基因組來源的基因來說，大腸埃希菌依然是最理想的克隆和表達(dá)宿主。也可以用其他宿主菌，例如被用來鑒定與新抗生素生物合成相關(guān)基因的淺青紫鏈霉菌和一些革蘭陰性細(xì)菌。也可以用穿梭黏?；駼AC載體將構(gòu)建于大腸埃希菌的文庫轉(zhuǎn)入其他宿主，如鏈霉菌屬或假單胞菌屬中。根據(jù)不同微生物產(chǎn)生活性物質(zhì)的差異和研究目標(biāo)的不同，選擇不同的宿主。隨著技術(shù)的成熟和新宿主的選擇，基因篩選率和功能基因檢測率得以提高，進(jìn)而宏基因組文庫的目標(biāo)基因的表達(dá)也得以提高。

1.2宏基因組文庫的篩選

根據(jù)研究目的，宏基因組文庫的篩選通常有功能篩選和序列篩選兩種方法。功能篩選最常用方法是根據(jù)重組克隆產(chǎn)生一些酶蛋白功能活性，采用各種檢測手段，挑選活性克隆子，得到完整的功能基因和帶有目的基因的基因簇，發(fā)現(xiàn)全新的基因或活性物質(zhì)。功能篩選首先要求功能基因或帶有目的的基因簇在宿主中表達(dá)，但因其受到檢測手段的限制，往往是在數(shù)千個甚至數(shù)百萬個重組克隆子中才能檢測到有用的活性克隆。序列篩選是依賴于目的基因的保守DNA序列，以序列相似性為基礎(chǔ)，執(zhí)行某類功能的酶可能具有相似的基因序列，根據(jù)已有的序列信息設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增或雜交篩選陽性克隆子。序列篩選一般只能獲得結(jié)構(gòu)基因的片段，而不能獲得完整的功能基因；但是，它可以將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)志并將其作為探針篩選宏基因文庫，以獲得完整的功能基因。用這種方法有可能篩選到某一類結(jié)構(gòu)或功能的蛋白質(zhì)中的新分子。

宏基因組文庫的篩選除了功能篩選和序列篩選法外，還可以采用底物誘導(dǎo)基因表達(dá)法（sub-strate-induced　gene　expression，SIGEX）。SIGEX是以代謝相關(guān)基因或酶基因往往有底物存在的條件下才表達(dá)，反之則不表達(dá)的原理來篩選目的代謝基因的。SIGEX的優(yōu)點(diǎn)在于它為高通量篩選提供了保障，而且不需要對底物進(jìn)行修飾。

2　宏基因組學(xué)在口腔微生物研究領(lǐng)域中的應(yīng)用

2.1口腔微生物群落結(jié)構(gòu)分析

口腔是一個由大量微生物組成的復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，人類口腔中寄居著大約700多種細(xì)菌。人類口腔適宜的溫度、濕度，豐富的營養(yǎng)來源，結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和理化性質(zhì)的不同，為口腔內(nèi)各種微生物的生長、繁殖和定居提供了非常適宜的環(huán)境，因而也就造就了口腔微生物群的多樣性?？谇晃⑸锎蟛糠挚梢韵嗷リP(guān)聯(lián)并形成生物膜，抵抗機(jī)械清除力或抗生素治療，但是在環(huán)境變化或其他口腔情況（如個人口腔衛(wèi)生質(zhì)量）變化觸發(fā)時，它們也可成為致病微生物。

菌斑指示劑和傳統(tǒng)培養(yǎng)方法以及常規(guī)的PCR特異性擴(kuò)增的分子生物學(xué)方法在某種程度上都不能完整地反映整個微生物群落的組成和動態(tài)變化，不適合用其研究復(fù)雜的口腔微生物群落。此外，在難培養(yǎng)或不可培養(yǎng)的微生物當(dāng)中，可能也有致病菌匿藏其中，因而也不能有效地用其研究與病程相關(guān)的微生物。

隨著分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)技術(shù)的發(fā)展，在基因組學(xué)的基礎(chǔ)上誕生了宏基因組學(xué)這一門嶄新的交叉學(xué)科。宏基因組學(xué)是繼發(fā)明顯微鏡以來研究微生物最重要的進(jìn)展，將為微生物世界帶來革命性的突破。Turnbaugh等利用16S　rRNA基因測序發(fā)現(xiàn)：胖人和瘦人的內(nèi)臟中有著不同的微生物菌群；當(dāng)胖人減肥的時候，他們內(nèi)臟中的細(xì)菌群基因也同樣發(fā)生變化，更加接近瘦人內(nèi)臟中的細(xì)菌群。

基于常規(guī)的口腔細(xì)菌培養(yǎng)方法和細(xì)胞學(xué)顯微鏡檢查，目前公認(rèn)變異鏈球菌和乳酸桿菌等是引起齲病的主要致病菌；但是，隨著宏基因組學(xué)在微生物的種類和多樣性研究中的應(yīng)用，有關(guān)齲病是由單一細(xì)菌引起或是由生物膜中的多種細(xì)菌引起的定論面臨質(zhì)疑。目前普遍認(rèn)為，齲病并不是僅由變異鏈球菌或其他任何一種菌斑中的細(xì)菌單獨(dú)引起的，而是由各種產(chǎn)酸菌相互作用的結(jié)果。

Aas等在對51名齲患者的1285個菌斑細(xì)菌的16S　rRNA序列進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，50％的細(xì)菌不能識別，一些新的細(xì)菌菌種與齲病的發(fā)生有關(guān)。Keijser等在用焦磷酸測序法分析健康人涎液和牙菌斑中細(xì)菌群時發(fā)現(xiàn)，口腔微生物具有多樣性。即他們從98名健康成人口腔中取得的牙菌斑就由1萬個微生物表型組成，其種族數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過之前報(bào)道的通過培養(yǎng)或者傳統(tǒng)克隆和測序技術(shù)定義的700種口腔微生物表型。

Zaura等在利用焦磷酸測序技術(shù)檢測了3名健康高加索人口腔內(nèi)5個部位的微生物組后發(fā)現(xiàn)，在健康人的口腔中微生物有3600種獨(dú)特物序列，超過500種不同的分類單元或“物種級”表型和88～104種高級分類群，每個單獨(dú)的樣品平均藏匿有266種分類單元。從這3名個體微生物組的測序結(jié)果分析可知，高級分類群、分類單元和獨(dú)特序列都有一個較大的重疊，即84％的高級分類群、75％的分類單元和65％的獨(dú)特序列至少在這3個微生物組中的2個組中存在。這3名個體的總共6315個獨(dú)特序列中有1660個相同序列，這1660個相同序列，即“核心微生物組”貢獻(xiàn)了66％的測序內(nèi)容，重疊的分類單元貢獻(xiàn)了94％的內(nèi)容，而幾乎所有的內(nèi)容（99.8％）都屬于共享的高級分類群。

研究證實(shí)，在不同的健康人的口腔微生物中，大部分微生物組是相同的，提示可能存在健康口腔核心微生物組。Kanasi等在對80名患齲和無齲嬰幼兒牙菌斑微生物的16S　rRNA序列克隆分析中發(fā)現(xiàn)，兩者之間存在著139種不同微生物。Gross等通過酶促法測序技術(shù)對無齲和患齲年輕恒牙牙菌斑微生物的16S　rRNA序列進(jìn)行分析后認(rèn)為，齲齒中產(chǎn)酸菌除了變異鏈球菌和乳酸桿菌外，月形單胞菌、奈瑟菌和緩癥鏈球菌同樣是潛在的產(chǎn)酸細(xì)菌。Willner等等在利用高通量測序技術(shù)檢測了19名健康人口腔咽部的病毒宏基因組序列后發(fā)現(xiàn)，口腔咽部是一個潛在的被噬菌體T3侵蝕的腸道菌儲存庫。另外，他們還發(fā)現(xiàn)了編碼血小板凝集因子PblA和PblB的兩個寄生于變異鏈球菌中的噬菌體sm-1基因，而之前有研究稱在心內(nèi)膜上發(fā)現(xiàn)了變異鏈球菌。這說明，口腔中的病毒與心臟疾病存在潛在的聯(lián)系。

宏基因組學(xué)技術(shù)可以避開傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，在DNA水平來探討口腔微生物群落結(jié)構(gòu)及其與環(huán)境微生物的關(guān)系。微生物多樣性在基因水平上主要表現(xiàn)為基因組大小和基因數(shù)目的多樣性，遺傳物質(zhì)化學(xué)組成的多樣性和某些特異性序列的差異。宏基因組技術(shù)為研究口腔微生物復(fù)雜群落和多樣性提供了重要的技術(shù)手段，通過快速可靠地獲得口腔微生物中各種微生物的菌落指紋和特征性核苷酸序列，以系統(tǒng)分析口腔微生物的多樣性及其分類地位，發(fā)掘豐富的口腔微生物資源。

2.2口腔微生物宏基因組文庫中的新型基因篩選及其功能

宏基因組學(xué)除了研究微生物群落結(jié)構(gòu)及其功能外，還可用于發(fā)現(xiàn)新的基因和開發(fā)新的微生物活性物質(zhì)。Jiang等構(gòu)建土壤宏基因文庫，成功地克隆和鑒定出一種新型的β-葡萄糖苷酶基因，該基因包含一個由151個氨基酸編碼組成的多肽。該研究對深入挖掘土壤未培養(yǎng)微生物的β-葡萄糖苷酶基因資源和該基因功能具有的重要意義。陳春嵐等從富集培養(yǎng)物宏基因組文庫中篩選出一個表達(dá)木聚糖酶基因umxyn10B，該基因大小為999bp，編碼產(chǎn)物的氨基酸序列具有較好的同源性。對其功能進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，該酶具有優(yōu)良的理化特性，可廣泛應(yīng)用于食品、能源、造紙和紡織等行業(yè)。Yu等利用宏基因功能篩選發(fā)現(xiàn)的兩個新型低溫活性酶脂EstM-N1和EstM-N2，屬于細(xì)菌脂肪分解酶Ⅷ家族成員。這一發(fā)現(xiàn)將推動生物催化劑的應(yīng)用。

篇（7）

中圖分類號：R249 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1673-7717（2008）04-0826-02

證候是中醫(yī)學(xué)的一個特有的概念，是辨證論治的核心和精髓。證候的標(biāo)準(zhǔn)化和定量化問題一直是中醫(yī)學(xué)的一個棘手問題。在中醫(yī)藥學(xué)現(xiàn)代化的進(jìn)程中，證候的現(xiàn)代化研究也被當(dāng)作了中醫(yī)藥學(xué)現(xiàn)代化的突破點(diǎn)。隨著現(xiàn)代基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的迅猛發(fā)展，中醫(yī)學(xué)界正在掀起結(jié)合的浪潮，隨著人類基因組計(jì)劃的完成和后基因組時代的到來為中醫(yī)證候的研究帶來了新的機(jī)遇，如何實(shí)現(xiàn)“證候-基因組學(xué)”闡釋是目前中醫(yī)藥研究的熱點(diǎn)。

1傳統(tǒng)概念

證候是醫(yī)者對病人的癥狀、舌脈、病情變化、治療經(jīng)過、個體情況、地土方宜等狀況，經(jīng)過四診八綱的分析，采用某種辨證方法得出的一個總的概括性結(jié)論；是在疾病發(fā)展過程中的某一階段的病理概括，可以認(rèn)為證候是人體在疾病發(fā)展過程中的某一階段的反應(yīng)狀態(tài)。證會隨著疾病的進(jìn)退而變化，是一個相對穩(wěn)定的具有時間性、階段性、變化性的概念。

2沈自尹院士認(rèn)為的證研究難點(diǎn)

①證是一種功能態(tài)的，可以發(fā)展，可以轉(zhuǎn)化；②證的概念應(yīng)用亦較混亂，靈活性大，辨證可因人而異，只有憑醫(yī)生的分析概括水平；③難以定性、定量、更難以定位。可見中醫(yī)證的研究已成為影響中醫(yī)藥學(xué)發(fā)展的關(guān)鍵問題。證是一種有機(jī)綜合的功能態(tài)，由一個調(diào)控中心及其所屬的眾多分子網(wǎng)絡(luò)所構(gòu)成，作為對外界反應(yīng)與自我調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)。那么這個網(wǎng)絡(luò)是什么呢？就是五臟網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。

3五臟網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)

人的形體、臟腑、經(jīng)脈、氣穴、溪骨既有各自不同的功能，又彼此聯(lián)系，內(nèi)外相應(yīng)、六合會通，共同發(fā)揮整體調(diào)控作用。這些聯(lián)系從內(nèi)環(huán)境來看，表現(xiàn)為臟與臟之間功能協(xié)同關(guān)系，臟與腑之間的表里關(guān)系，腑與腑之間的相互傳化關(guān)系，臟腑與經(jīng)絡(luò)之間的相互絡(luò)屬關(guān)系，及臟腑與五官、五體、五液之間，臟腑與精、氣、血、津液之間的互藏互用關(guān)系。從外環(huán)境看，表現(xiàn)為五臟系統(tǒng)與自然界之間的授受關(guān)系，與五音、五味、五季、五方的廣泛聯(lián)系，形成了以五行屬性為綱的整個自然界的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。五臟之間密切相關(guān),每一臟都含有其他臟之氣,而每一臟之氣又都滲透到其他臟之中,調(diào)整著相互之間的關(guān)系。五臟之間相互依存,相互制約,每一臟的功能都再與它臟的交互聯(lián)系中發(fā)揮作用。

五臟網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)整體由心系統(tǒng)主宰，與其它各層次系統(tǒng)（子系統(tǒng)）的功能活動相互協(xié)調(diào)，使系統(tǒng)整體功能處于有序、協(xié)調(diào)和穩(wěn)定狀態(tài)。五臟功能網(wǎng)絡(luò)并非機(jī)械的、自閉的，而是與時空聯(lián)系在一起的。

4五臟網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)與基因組網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)

宏觀整體和微觀基因組整體有嚴(yán)密的同一性，宏觀整體規(guī)律和微觀基因組規(guī)律有同一性，宏觀的五臟網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)必然有微觀的基因組網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)相互對應(yīng)?；蚪M整體由五臟基因組集團(tuán)構(gòu)成，臟基因組集團(tuán)間的聯(lián)系路線是經(jīng)絡(luò)系統(tǒng)的根源，五臟基因組依靠微觀的經(jīng)絡(luò)系統(tǒng)的聯(lián)系的相互作用形成了一個生命的統(tǒng)一體。

從證的機(jī)理來講，證與五臟是密切相關(guān)的；從證與基因組的關(guān)系來講，基因是里，證是表，證與基因的關(guān)系也是密切的，與基因組內(nèi)部的功能作用路線是有關(guān)。中醫(yī)辨證方法有八綱、六經(jīng)、衛(wèi)氣營血、臟腑和三焦辨證等。而證又是有個體差異的，因而被認(rèn)為與基因型相關(guān)。從基因組的角度講，基因表達(dá)正常與協(xié)調(diào)為“正氣”，反之為“病氣”。1979年根據(jù)著名老中醫(yī)關(guān)幼波的臨床經(jīng)驗(yàn)，將肝病分為8個主型，36個亞型。因而證的基因組定位也是有主次的，多點(diǎn)的，與基因組的微觀經(jīng)絡(luò)系統(tǒng)、臟基因塊及其作用調(diào)控途徑有關(guān)。由證可以推出與某組蛋白質(zhì)組有關(guān),而這組蛋白質(zhì)組又與某組基因組相關(guān)，因此可以推出肝臟基因組塊的微細(xì)結(jié)構(gòu)以及證的基因組機(jī)理。證候基因組定位是某些基因之間相互聯(lián)系和表達(dá)量大小。證候的本質(zhì)因此是某些基因組成的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。

5證候－基因組研究

為促進(jìn)中醫(yī)藥與現(xiàn)代生命科學(xué)的前沿―基因組學(xué)的溝通，尋求新的研究和發(fā)展領(lǐng)域與途徑，國家中醫(yī)藥管理局科技教育司于1999 年3 月14-15 日在北京召開了中醫(yī)藥與基因組學(xué)研討會。在中醫(yī)藥與基因組學(xué)研究相互滲透的可能性中醫(yī)藥與基因組學(xué)結(jié)合的研究領(lǐng)域、基因組學(xué)與中醫(yī)藥交叉滲透的切入點(diǎn)3個方面進(jìn)行了廣泛的交流，取得“證候-基因組”研究的共識?！白C候-基因組學(xué)”定義為在證候理論指導(dǎo)下，運(yùn)用功能基因組學(xué)的方法，通過探討證候，特別是同病異證或異病同證時基因的變異及差異表達(dá)情況，揭示與某一證候形成相關(guān)的所有基因及其功能，從整體基因表達(dá)的水平闡明證候的本質(zhì)。

“證候-基因組”的切入證候的研究也應(yīng)當(dāng)包含基因組的兩個層次，即證候的單核苷酸多態(tài)研究和證候的基因表達(dá)譜研究。前者應(yīng)從異病同證角度切入，這樣才能發(fā)現(xiàn)與證候的關(guān)系密切的核苷酸多態(tài)，但是研究者要從整體上把握證候與SNP 的關(guān)系，就必須通過對全部一千萬個SNP 位點(diǎn)都進(jìn)行基因分型，其難度是相當(dāng)大的。“證候-基因表達(dá)譜”研究主要針對參與表達(dá)的約3 萬個基因，故從理論上把握證候的整體基因表達(dá)是可行的，因此目前“證候-基因組”研究以“證候-基因表達(dá)譜”為重點(diǎn)。

當(dāng)代有許多中醫(yī)學(xué)者專家比如王米渠先生在努力研究中醫(yī)證候和基因組的結(jié)合，試圖在基因組的研究中揭示出中醫(yī)的證或者證候的本質(zhì)。他們克服了方法論、試驗(yàn)重復(fù)性差、海量數(shù)據(jù)處理等困難，在證候－基因組研究中取得了可喜的一步，為揭示中醫(yī)證候的本質(zhì)為中醫(yī)現(xiàn)代化作出了杰出貢獻(xiàn)。

但是當(dāng)代證候－基因組研究也存在許多的不足，例如：如何證候-基因表達(dá)譜動態(tài)中表現(xiàn)出證候的定量變化，基因組圖譜中的基因相互關(guān)系怎樣如何隨著證的逐漸變化而發(fā)展的等等。將基因組圖譜作為證候的本質(zhì)不能說明問題，似乎有將中醫(yī)走向還原論的可能，已經(jīng)有許多學(xué)者提出了批評。

6證候－基因組研究的建議

證候－基因組研究作為證候現(xiàn)代化研究的初步，能作出這樣的成果是不能提出任何批評的，但是為了進(jìn)一步的發(fā)展不能不對現(xiàn)已經(jīng)作出的成果和經(jīng)驗(yàn)作出應(yīng)有的總結(jié)和審核。

（1）重悟輕測是中醫(yī)傳統(tǒng)的認(rèn)知方法，中醫(yī)對人體生理、病理的認(rèn)識體現(xiàn)了這一點(diǎn)。藏象系統(tǒng)就是通過直覺提出的?，F(xiàn)在的證候－基因組研究看起來走向了另一極端，沒有和中醫(yī)原來的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來。筆者認(rèn)為，證候－基因組研究應(yīng)該和中醫(yī)基因組學(xué)結(jié)合起來，將分析測定和整體思維直覺思維結(jié)合起來，達(dá)到悟測并重，在測定中結(jié)合整體思維，在整體思維中測定，相互驗(yàn)證。

（2）中醫(yī)學(xué)在觀察分析和研究處理問題時，注重的時事物的功能、屬性、作用，而不是形態(tài)和結(jié)構(gòu)?；蚪M整體時結(jié)構(gòu)和功能的統(tǒng)一，認(rèn)識基因組整體必須堅(jiān)持功能分析和結(jié)構(gòu)分析的統(tǒng)一，在實(shí)踐中將二者結(jié)合起來，相互促進(jìn)而快速達(dá)到目的。

（3）基因組是相互聯(lián)系的整體，研究證候基因組必須從基因組整體出發(fā)，基因是整體中的部分，是全息性的部分，從整體出發(fā)才不會走向還原論，而保持中醫(yī)的整體特色。

（4）中醫(yī)堅(jiān)持臨床研究和試驗(yàn)研究的結(jié)合，證候是基因組的網(wǎng)絡(luò)出現(xiàn)的不和諧的問題，臨床有大量的證候都可以利用，可以在證候的研究中發(fā)現(xiàn)深刻的基因組聯(lián)系；把臨床研究與試驗(yàn)研究結(jié)合起來，相互彌補(bǔ)，利用各種分子生物學(xué)技術(shù)和手段可以發(fā)現(xiàn)基因組內(nèi)的整體聯(lián)系。

證候?qū)W是可以結(jié)合現(xiàn)代的分子生物學(xué)技術(shù)，闡述證候的整體本質(zhì)，讓中醫(yī)學(xué)的整體色彩在新的時代重新煥發(fā)出新的光輝；否則就可能落后，隨著生命本質(zhì)的研究繼續(xù)深入，中醫(yī)學(xué)就可能被取代?；蚪M學(xué)是現(xiàn)代生命科學(xué)由還原論走向整體論的節(jié)點(diǎn)，而中醫(yī)基因組學(xué)的建立不但促進(jìn)這種趨勢，而且可以促進(jìn)中醫(yī)藥學(xué)的現(xiàn)代化發(fā)展。中醫(yī)藥學(xué)只有在結(jié)合吸收了現(xiàn)代科學(xué)的優(yōu)秀還原論優(yōu)勢，在整體理論指導(dǎo)下分化重新整合而走向新的整體論高峰。

參考文獻(xiàn)

篇（8）

        早在20世紀(jì)50年代我們就知道遺傳因素對藥物反應(yīng)的影響，典型的例子是蠶豆病，該病因遺傳缺陷導(dǎo)致葡萄糖6-磷酸脫氫酶（G6PD）缺乏，或活性低下，引起一系列生化代謝異常，一般情況下患者無癥狀，但在吃蠶豆或使用抗瘧藥伯氨喹啉類及其他具有強(qiáng)氧化作用的藥物后就會出現(xiàn)急性溶血反應(yīng)；再有就是異煙肼的乙?；饔茫騻€體乙?；俣炔煌?，導(dǎo)致不同個體使用同等劑量異煙肼時出現(xiàn)療效差異，甚或發(fā)生毒副反應(yīng)的現(xiàn)象。20世紀(jì)90年代，藥物基因組學(xué)的出現(xiàn)使我們對不同個體用藥后的藥物反應(yīng)差異有了更深入了解，對很多以前難以解釋的藥物反應(yīng)現(xiàn)象有了合理的解釋，對指導(dǎo)臨床合理用藥也有了更加科學(xué)的依據(jù)。

        1  藥物基因組學(xué)的概念

        藥物基因組學(xué)是基因功能學(xué)與分子藥理學(xué)的有機(jī)結(jié)合，是研究基因序列變異及其藥物不同反應(yīng)的科學(xué)，以藥物效應(yīng)及安全性為目標(biāo)，運(yùn)用已知的基因理論研究各種基因突變與藥效及安全性的關(guān)系，藥物基因組學(xué)強(qiáng)調(diào)個體化；通過它可為患者或者特定人群尋找合適的藥物及恰當(dāng)?shù)膭┝浚纳撇∪说闹委熜Ч?/p>

        2  藥物基因組學(xué)的臨床意義

        藥物基因組學(xué)的研究涉及儲多藥物，本文僅以以下兩類藥物的基因組學(xué)研究成果來表述基因組學(xué)對指導(dǎo)臨床用藥的意義。

        2.1氨基糖苷類藥物與耳聾

        氨基糖苷類抗生素自1945年問世以來，因其殺菌作用強(qiáng)、抗菌譜較寬且價格低廉而在臨床上廣為應(yīng)用，但其致耳聾的毒性反應(yīng)也一直困擾著全世界的醫(yī)生。我國有聽力殘疾2000萬人，其中60%～80%為氨基糖苷類藥物中毒所致。

        氨基糖苷類抗生素致聾可分為兩類，一類因接受了毒性劑量而致聾；另一類則與遺傳因素相關(guān)。國內(nèi)外學(xué)者均證實(shí)：線粒體基因第1555位點(diǎn)A-G的均值性點(diǎn)突變和氨基糖苷類誘導(dǎo)的耳聾關(guān)系非常密切。[1]即帶有線粒體A1555G點(diǎn)突變基因，哪怕是僅接受常規(guī)劑量或僅一次接觸氨基糖苷類即可致不可逆的聽力損失。這類耳聾占全部氨基糖苷類抗生素致聾患者的30%左右。目前，我國已繪制出不同于西方國家的耳聾基因突變譜，也已開發(fā)出針對中國人的耳聾基因芯片檢測體系。如能在新生兒出生時或出生后3天內(nèi)采集臍帶血或足跟血篩查聾病易感基因，[2]使易感基因攜帶者終生避免使用氨基糖苷類藥物，則可避免“一針致聾”的悲劇。

        2.2抗高血壓藥物的選擇與劑量

        原發(fā)性高血壓的發(fā)生與環(huán)境因素（生活習(xí)慣、煙酒嗜好等）和遺傳因素關(guān)系密切。目前，臨床常用的抗高血壓藥可分為五類：利尿藥、β-受體阻斷藥、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、血管緊張素II受體阻斷藥和鈣通道阻滯藥，大多數(shù)情況下醫(yī)生制定治療方案主要根據(jù)病人的年齡、體重、高血壓程度、有無并發(fā)癥等，憑經(jīng)驗(yàn)、試驗(yàn)性地選擇藥物和藥物劑量，較少考慮遺傳因素，很多高血壓病人雖已用藥，但并未能取得滿意療效。藥物基因組學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)：抗高血壓藥物的療效與藥物遺傳多態(tài)性有密切關(guān)系，如能在用藥前測定病人的基因類型，有目的地選擇藥物和藥物劑量，既可使疾病得到及時有效的治療、減少不良反應(yīng)的發(fā)生，也能減少醫(yī)療費(fèi)用的支出。

篇（9）

早在20世紀(jì)50年代我們就知道遺傳因素對藥物反應(yīng)的影響，典型的例子是蠶豆病，該病因遺傳缺陷導(dǎo)致葡萄糖6-磷酸脫氫酶（G6PD）缺乏，或活性低下，引起一系列生化代謝異常，一般情況下患者無癥狀，但在吃蠶豆或使用抗瘧藥伯氨喹啉類及其他具有強(qiáng)氧化作用的藥物后就會出現(xiàn)急性溶血反應(yīng)；再有就是異煙肼的乙?；饔?，因個體乙酰化速度不同，導(dǎo)致不同個體使用同等劑量異煙肼時出現(xiàn)療效差異，甚或發(fā)生毒副反應(yīng)的現(xiàn)象。20世紀(jì)90年代，藥物基因組學(xué)的出現(xiàn)使我們對不同個體用藥后的藥物反應(yīng)差異有了更深入了解，對很多以前難以解釋的藥物反應(yīng)現(xiàn)象有了合理的解釋，對指導(dǎo)臨床合理用藥也有了更加科學(xué)的依據(jù)。

1 藥物基因組學(xué)的概念

藥物基因組學(xué)是基因功能學(xué)與分子藥理學(xué)的有機(jī)結(jié)合，是研究基因序列變異及其藥物不同反應(yīng)的科學(xué)，以藥物效應(yīng)及安全性為目標(biāo)，運(yùn)用已知的基因理論研究各種基因突變與藥效及安全性的關(guān)系，藥物基因組學(xué)強(qiáng)調(diào)個體化；通過它可為患者或者特定人群尋找合適的藥物及恰當(dāng)?shù)膭┝?，改善病人的治療效果?/p>

2 藥物基因組學(xué)的臨床意義

藥物基因組學(xué)的研究涉及儲多藥物，本文僅以以下兩類藥物的基因組學(xué)研究成果來表述基因組學(xué)對指導(dǎo)臨床用藥的意義。

2.1氨基糖苷類藥物與耳聾

氨基糖苷類抗生素自1945年問世以來，因其殺菌作用強(qiáng)、抗菌譜較寬且價格低廉而在臨床上廣為應(yīng)用，但其致耳聾的毒性反應(yīng)也一直困擾著全世界的醫(yī)生。我國有聽力殘疾2000萬人，其中60%～80%為氨基糖苷類藥物中毒所致。

氨基糖苷類抗生素致聾可分為兩類，一類因接受了毒性劑量而致聾；另一類則與遺傳因素相關(guān)。國內(nèi)外學(xué)者均證實(shí)：線粒體基因第1555位點(diǎn)A-G的均值性點(diǎn)突變和氨基糖苷類誘導(dǎo)的耳聾關(guān)系非常密切。[1]即帶有線粒體A1555G點(diǎn)突變基因，哪怕是僅接受常規(guī)劑量或僅一次接觸氨基糖苷類即可致不可逆的聽力損失。這類耳聾占全部氨基糖苷類抗生素致聾患者的30%左右。目前，我國已繪制出不同于西方國家的耳聾基因突變譜，也已開發(fā)出針對中國人的耳聾基因芯片檢測體系。如能在新生兒出生時或出生后3天內(nèi)采集臍帶血或足跟血篩查聾病易感基因，[2]使易感基因攜帶者終生避免使用氨基糖苷類藥物，則可避免“一針致聾”的悲劇。

2.2抗高血壓藥物的選擇與劑量

原發(fā)性高血壓的發(fā)生與環(huán)境因素（生活習(xí)慣、煙酒嗜好等）和遺傳因素關(guān)系密切。目前，臨床常用的抗高血壓藥可分為五類：利尿藥、β-受體阻斷藥、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、血管緊張素II受體阻斷藥和鈣通道阻滯藥，大多數(shù)情況下醫(yī)生制定治療方案主要根據(jù)病人的年齡、體重、高血壓程度、有無并發(fā)癥等，憑經(jīng)驗(yàn)、試驗(yàn)性地選擇藥物和藥物劑量，較少考慮遺傳因素，很多高血壓病人雖已用藥，但并未能取得滿意療效。藥物基因組學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)：抗高血壓藥物的療效與藥物遺傳多態(tài)性有密切關(guān)系，如能在用藥前測定病人的基因類型，有目的地選擇藥物和藥物劑量，既可使疾病得到及時有效的治療、減少不良反應(yīng)的發(fā)生，也能減少醫(yī)療費(fèi)用的支出。

2.2.1β-受體阻斷藥 β-受體阻斷藥通過降低交感神經(jīng)功能產(chǎn)生降壓作用。影響大部分β-受體阻斷藥代謝的酶是細(xì)胞色素P450酶(CYP)系中的CYP2D6，該酶具有遺傳多態(tài)性，其基因變異可高度影響CYP2D6的活性。[3]CYP2D6可分為弱代謝型(PM)、中間代謝型(IM)、強(qiáng)代謝型(EM)和超強(qiáng)代謝型(UEM) 4種表型。PM的發(fā)生是由于CYP2D6基因突變造成酶活性的缺陷，此型患者代謝藥物的能力下降，可導(dǎo)致血藥濃度過高， 易誘發(fā)嚴(yán)重的不良反應(yīng)如支氣管哮喘、心血管疾病，甚至死亡，對此基因型病人，臨床用藥應(yīng)減少藥量。IM型者屬于強(qiáng)代謝者中較弱的一部分，因基因突變導(dǎo)致酶活性略微降低，此類病人用藥也應(yīng)適當(dāng)減少劑量。EM是正常人群的代謝表型，故臨床上使用常規(guī)治療劑量有效。UEM則是由于出現(xiàn)CYP2D6的多基因拷貝，使酶蛋白高度表達(dá)，導(dǎo)致酶活性的顯著增高，此基因型代謝藥物能力強(qiáng)，從而使血藥濃度降低而達(dá)不到治療效果，故應(yīng)適當(dāng)增加藥量，[4]或改用其他藥物。

藥效學(xué)機(jī)制對β-受體阻斷藥反應(yīng)的影響較藥動學(xué)機(jī)制更為重要。體內(nèi)β-受體的數(shù)量和受體對藥物敏感性的變化是造成個體對β-受體阻斷藥反應(yīng)差異的主要原因之一。[5]目前已知β1-受體存在兩種突變， 一種位于受體蛋白N端49位，由甘氨酸取代絲氨酸(Ser49Gly)，另一種位于C端389位，由甘氨酸取代精氨酸(Arg389Gly)。研究表明：突變型純合子( Gly 49 及Gly389) 對β-受體阻斷藥反應(yīng)都不及野生型。[4]也就是說，由于基因突變，導(dǎo)致患者對β-受體阻斷藥的敏感性下降；另一方面，遺傳背景不同的種族對β-受體阻斷藥或激動藥的敏感性也存在著差異，[5]這些差異都影響到β-受體阻斷藥臨床應(yīng)用時的劑量選擇。

2.2.2噻嗪類利尿藥 噻嗪類利尿藥是最常用的基礎(chǔ)降壓藥物，其降壓原理是促進(jìn)鈉水排出，減少有效血容量，并擴(kuò)張外周血管使血壓下降。與噻嗪類利尿藥降壓作用個體差異相關(guān)的基因有：α-內(nèi)收蛋白（α-adducin）、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）的基因、G蛋白基因、編碼WNK酶的基因，此外， NO酶、E298D 突變也與噻嗪類利尿藥的降壓效果有關(guān)。[4]

目前發(fā)現(xiàn)α-Adducin 具功能意義的突變?yōu)镚460T，大量的研究表明， 含至少1個460T突變基因的患者使用利尿藥的近期效應(yīng)是血壓(包括平均動脈壓)下降幅度更大， 而遠(yuǎn)期效應(yīng)則表現(xiàn)為相對其他降壓藥物而言更明顯的降低心肌梗死和中風(fēng)的發(fā)生率。[4]國內(nèi)有學(xué)者[6]報(bào)道：ACE基因I/D多態(tài)性和氫氯噻嗪的降壓作用密切相關(guān)，但目前研究結(jié)果還不太一致。有報(bào)道說：對同時攜帶ACE的I型等位基因及adducin的Trp460等位基因的患者氫氯噻嗪的療效最好，而攜帶ACE的D/D等位基因及adducin的Gly/Trp等位基因的患者用氫氯噻嗪治療后血壓下降最少，[7]所以臨床用藥時如能聯(lián)合分析ACE和α-adducin兩方面的基因多態(tài)性，則有助于預(yù)測利尿劑的療效。

2.2.3血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI) ACEI的降壓作用主要通過抑制周圍和組織中的ACE，使血管緊張素II生成減少，同時抑制緩激肽酶使緩激肽降解減少，而達(dá)到降壓目的。ACEI與基因多態(tài)性關(guān)系的研究主要集中在RAAS，多態(tài)位點(diǎn)包括ACE基因I/D、AGT基因M235T和血管緊張素II- I型受體（AT1R）基因A1166C。[8]其中研究最廣泛的是ACE基因I/D多態(tài)性，用卡托普利、依那普利、賴諾普利和培垛普利研究ACEI抗高血壓的療效，研究結(jié)果并不一致，說明：原發(fā)性高血壓患者對ACEI類藥物反應(yīng)的差異部分由遺傳因素決定。有人發(fā)現(xiàn)AT1基因多態(tài)性(A1166C)與ACEI類藥物的降壓療效相關(guān)，且此相關(guān)性在老年患者和超體重患者中尤為明顯。[7]

2.2.4血管緊張素Ⅱ受體阻滯藥 沙坦類降壓藥主要通過阻滯血管緊張素Ⅱ受體，降低外周血管阻力，產(chǎn)生降壓作用。沙坦類藥物在體內(nèi)主要依靠CYP2C9代謝， 該基因突變使酶活性明顯下降，毒性增加， 療效降低。另外， CYP11B2 的多態(tài)性被證實(shí)與血管緊張素Ⅱ受體阻滯藥的降壓效果相關(guān)，該基因突變引起機(jī)體對血管緊張素Ⅱ受體阻滯藥敏感性增加， 表現(xiàn)為收縮壓下降較無突變型明顯。[4]

2.2.5鈣通道阻滯藥(CCI) 鈣通道阻滯藥是近30年來廣泛應(yīng)用于臨床的一類治療心血管疾病的藥物，通過阻滯鈣離子L通道， 抑制血管平滑肌及心肌鈣離子內(nèi)流， 從而使血管平滑肌松弛心肌收縮力降低， 使血壓下降。鈣通道阻滯藥在體內(nèi)的代謝主要依靠CYP3A，該基因突變可引起CYP3A酶活性下降，可導(dǎo)致體內(nèi)血藥濃度增加， 藥物的毒性也相應(yīng)增加， 故應(yīng)適當(dāng)減少藥物的用量。[4]

3 展望

藥物基因組學(xué)經(jīng)過十幾年的發(fā)展，在藥物代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)和藥理作用的基因多態(tài)性的研究有很大的進(jìn)展。在有些藥物上有重大突破，如氨基糖苷類的耳聾問題，但更多的藥物研究還都處在起步階段，有待于更加深入的研究。相信隨著病理、藥理機(jī)制研究的深入、藥物基因組學(xué)研究方法及新技術(shù)的不斷的完善，以及個體化用藥基因芯片的研發(fā)，不久的將來，很多藥物都可以實(shí)現(xiàn)以基因?yàn)閷?dǎo)向、“量體裁衣”式的個體化用藥治療模式，使臨床用藥更具針對性、高效性和安全性，實(shí)現(xiàn)治療學(xué)上按基因選藥的個體化用藥的飛躍。 參 考 文 獻(xiàn)

[1]戴樸.聾病的臨床基因診斷[OL].cmechina.net/content/200700003713/02/.

[2]王秋菊.新生兒聽力篩查 期待基因檢測加盟[N]. 健康報(bào)，2009-08-07.

[3]樊曉寒，惠汝太.β受體阻滯劑藥物基因組學(xué)研究進(jìn)展[J].中華心血管病雜志，2006. 34（10）947-950.

[4]唐強(qiáng)，劉海玲，劉昭前.抗高血壓藥物的基因組學(xué)研究進(jìn)展[J].中南藥學(xué)，2007.5（2）157-160.

[5]劉潔，周宏灝.遺傳藥理學(xué)個體化用藥的科學(xué)依據(jù)[J].中國處方藥，2007. (50)：32-33.

篇（10）

基因多態(tài)性是藥物基因組學(xué)的研究基礎(chǔ)。藥物效應(yīng)基因所編碼的酶、受體、離子通道作為藥物作用的靶，是藥物基因組學(xué)研究的關(guān)鍵所在。基因多態(tài)性可通過藥物代謝動力學(xué)和藥物效應(yīng)動力學(xué)改變來影響物的作用。

基因多態(tài)性對藥代動力學(xué)的影響主要是通過相應(yīng)編碼的藥物代謝酶及藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等的改變而影響藥物的吸收、分布、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝和生物轉(zhuǎn)化等方面。與物代謝有關(guān)的酶有很多，其中對細(xì)胞色素-P450家族與丁酰膽堿酯酶的研究較多?；蚨鄳B(tài)性對藥效動力學(xué)的影響主要是受體蛋白編碼基因的多態(tài)性使個體對藥物敏感性發(fā)生差異。

苯二氮卓類藥與基因多態(tài)性：咪唑安定由CYP3A代謝，不同個體對咪唑安定的清除率可有五倍的差異。地西泮是由CYP2C19和CYP2D6代謝，基因的差異在臨床上可表現(xiàn)為用藥后鎮(zhèn)靜時間的延長。

吸入與基因多態(tài)性：RYR1基因變異與MH密切相關(guān)，現(xiàn)在已知至少有23種不同的RYR1基因多態(tài)性與MH有關(guān)。氟烷性肝炎可能源于機(jī)體對在CYP2E1作用下產(chǎn)生的氟烷代謝產(chǎn)物的一種免疫反應(yīng)。

神經(jīng)肌肉阻滯藥與基因多態(tài)性：丁酰膽堿酯酶是水解琥珀酰膽堿和美維庫銨的酶，已發(fā)現(xiàn)該酶超過40種的基因多態(tài)性，其中最常見的是被稱為非典型的（A）變異體，與用藥后長時間窒息有關(guān)。

鎮(zhèn)痛藥物與基因多態(tài)性：μ-阿片受體是阿片類藥的主要作用部位，常見的基因多態(tài)性是A118G和G2172T?？纱蚝颓R多通過CYP2D6代謝。此外，美沙酮的代謝還受CYP3A4的作用。兒茶酚O-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)基因與痛覺的產(chǎn)生有關(guān)。

局部與基因多態(tài)性：羅哌卡因主要由CYP1A2和CYP3A4代謝。CYP1A2的基因多態(tài)性主要是C734T和G2964A，可能影響藥物代謝速度。

一直以來麻醉科醫(yī)生較其它專業(yè)的醫(yī)療人員更能意識到不同個體對藥物的反應(yīng)存在差異。的藥物基因組學(xué)研究將不僅更加合理的解釋藥效與不良反應(yīng)的個體差異，更重要的是在用藥前就可以根據(jù)病人的遺傳特征選擇最有效而副作用最小的藥物種類和劑型，達(dá)到真正的個體化用藥。

能夠準(zhǔn)確預(yù)測病人對麻醉及鎮(zhèn)痛藥物的反應(yīng)，一直是廣大麻醉科醫(yī)生追求的目標(biāo)之一。若能了解藥物基因組學(xué)的基本原理，掌握用藥的個體化原則，就有可能根據(jù)病人的不同基因組學(xué)特性合理用藥，達(dá)到提高藥效，降低毒性，防止不良反應(yīng)的目的。本文對藥物基因組學(xué)的基本概念和常用的藥物基因組學(xué)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

一、概述

二十世紀(jì)60年代對臨床麻醉過程中應(yīng)用琥珀酰膽堿后長時間窒息、硫噴妥鈉誘發(fā)卟啉癥及惡性高熱等的研究促進(jìn)了藥物遺傳學(xué)（Pharmacogenetics）的形成和發(fā)展,可以說這門學(xué)科最早的研究就是從麻醉學(xué)開始的。

藥物基因組學(xué)(Phamacogenomics)是伴隨人類基因組學(xué)研究的迅猛發(fā)展而開辟的藥物遺傳學(xué)研究的新領(lǐng)域，主要闡明藥物代謝、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)和藥物靶分子的基因多態(tài)性及藥物作用包括療效和毒副作用之間的關(guān)系。它是以提高藥物的療效及安全性為目標(biāo)，研究影響藥物吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝、消除等個體差異的基因特性，以及基因變異所致的不同病人對藥物的不同反應(yīng)，并由此開發(fā)新的藥物和用藥方法的科學(xué)。

1959年Vogel提出了“藥物遺傳學(xué)”,1997年Marshall提出“藥物基因組學(xué)”。藥物基因組學(xué)是藥物遺傳學(xué)的延伸和發(fā)展，兩者的研究方法和范疇有頗多相似之處，都是研究基因的遺傳變異與藥物反應(yīng)關(guān)系的學(xué)科。但藥物遺傳學(xué)主要集中于研究單基因變異，特別是藥物代謝酶基因變異對藥物作用的影響；而藥物基因組學(xué)除覆蓋藥物遺傳學(xué)研究范疇外，還包括與藥物反應(yīng)有關(guān)的所有遺傳學(xué)標(biāo)志，藥物代謝靶受體或疾病發(fā)生鏈上諸多環(huán)節(jié)，所以研究領(lǐng)域更為廣泛[1,2,3]。

二、基本概念

1．分子生物學(xué)基本概念

基因是一個遺傳密碼單位，由位于一條染色體(即一條長DNA分子和與其相關(guān)的蛋白)上特定位置的一段DNA序列組成。等位基因是位于染色體單一基因座位上的、兩種或兩種以上不同形式基因中的一種。人類基因或等位基因變異最常見的類型是單核苷酸多態(tài)性(single-nucleotidepolymorphism,SNP)。目前為止，已經(jīng)鑒定出13000000多種SNPs。突變和多態(tài)性常可互換使用，但一般來說，突變是指低于1%的群體發(fā)生的變異，而多態(tài)性是高于1%的群體發(fā)生的變異。

2．基因多態(tài)性的命名法：

(1)數(shù)字前面的字母代表該基因座上最常見的核苷酸(即野生型)，而數(shù)字后的字母則代表突變的核苷酸。例如：μ阿片受體基因A118G指的是在118堿基對上的腺嘌呤核苷酸(A)被鳥嘌呤核苷酸(G)取代，也可寫成118A/G或118A>G。

(2)對于單個基因密碼子導(dǎo)致氨基酸轉(zhuǎn)換的多態(tài)性編碼也可以用相互轉(zhuǎn)換的氨基酸的來標(biāo)記。例如：丁酰膽堿酯酶基因多態(tài)性Asp70Gly是指此蛋白質(zhì)中第70個氨基酸－甘氨酸被天冬氨酸取代。

三、藥物基因組學(xué)的研究內(nèi)容

基因多態(tài)性是藥物基因組學(xué)的研究基礎(chǔ)。藥物效應(yīng)基因所編碼的酶、受體、離子通道及基因本身作為藥物作用的靶，是藥物基因組學(xué)研究的關(guān)鍵所在。這些基因編碼蛋白大致可分為三大類:藥物代謝酶、藥物作用靶點(diǎn)、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等。其中研究最為深入的是物與藥物代謝酶CYP45O酶系基因多態(tài)性的相關(guān)性[1,2,3]。

基因多態(tài)性可通過藥物代謝動力學(xué)和藥物效應(yīng)動力學(xué)改變來影響藥物作用，對于臨床較常用的、治療劑量范圍較窄的、替代藥物較少的物尤其需引起臨床重視。

（一）基因多態(tài)性對藥物代謝動力學(xué)的影響

基因多態(tài)性對藥物代謝動力學(xué)

的影響主要是通過相應(yīng)編碼的藥物代謝酶及藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等的改變而影響藥物的吸收、分布、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝和生物轉(zhuǎn)化等方面[3,4,5,6]。

1、藥物代謝酶

與物代謝有關(guān)的酶有很多，其中對細(xì)胞色素-P450家族與丁酰膽堿酯酶的研究較多。

（1）細(xì)胞色素P-450（CYP45O）

物絕大部分在肝臟進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，參與反應(yīng)的主要酶類是由一個龐大基因家族編碼控制的細(xì)胞色素P450的氧化酶系統(tǒng)，其主要成分是細(xì)胞色素P-450（CYP45O）。CYP45O組成復(fù)雜，受基因多態(tài)性影響，稱為CYP45O基因超家族。1993年Nelson等制定出能反應(yīng)CYP45O基因超家族內(nèi)的進(jìn)化關(guān)系的統(tǒng)一命名法：凡CYP45O基因表達(dá)的P450酶系的氨基酸同源性大于40%的視為同一家族（Family），以CYP后標(biāo)阿拉伯?dāng)?shù)字表示，如CYP2；氨基酸同源性大于55%為同一亞族（Subfamily），在家族表達(dá)后面加一大寫字母，如CYP2D；每一亞族中的單個變化則在表達(dá)式后加上一個阿拉伯?dāng)?shù)字，如CYP2D6。

（2）丁酰膽堿酯酶

麻醉過程中常用短效肌松劑美維庫銨和琥珀酰膽堿，其作用時限依賴于水解速度。血漿中丁酰膽堿酯酶(假性膽堿酯酶)是水解這兩種藥物的酶，它的基因變異會使肌肉麻痹持續(xù)時間在個體間出現(xiàn)顯著差異。

2、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的多態(tài)性

轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白控制藥物的攝取、分布和排除。P-糖蛋白參與很多藥物的能量依賴性跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，包括一些止吐藥、鎮(zhèn)痛藥和抗心律失常藥等。P-糖蛋白由多藥耐藥基因（MDR1）編碼。不同個體間P-糖蛋白的表達(dá)差別明顯，MDR1基因的數(shù)種SNPs已經(jīng)被證實(shí)，但其對臨床麻醉的意義還不清楚。

（二）基因多態(tài)性對藥物效應(yīng)動力學(xué)的影響

物的受體（藥物靶點(diǎn)）蛋白編碼基因的多態(tài)性有可能引起個體對許多藥物敏感性的差異，產(chǎn)生不同的藥物效應(yīng)和毒性反應(yīng)[7,8]。

1、藍(lán)尼定受體-1（Ryanodinereceptor-1，RYR1）

藍(lán)尼定受體-1是一種骨骼肌的鈣離子通道蛋白，參與骨骼肌的收縮過程。惡性高熱（malignanthyperthermia,MH）是一種具有家族遺傳性的、由于RYR1基因異常而導(dǎo)致RYR1存在缺陷的亞臨床肌肉病，在揮發(fā)性吸入和琥珀酰膽堿的觸發(fā)下可以出現(xiàn)骨骼肌異常高代謝狀態(tài)，以至導(dǎo)致患者死亡。

2、阿片受體

μ-阿片受體由OPRM1基因編碼，是臨床使用的大部分阿片類藥物的主要作用位點(diǎn)。OPRM1基因的多態(tài)性在啟動子、內(nèi)含子和編碼區(qū)均有發(fā)生，可引起受體蛋白的改變。嗎啡和其它阿片類藥物與μ-受體結(jié)合而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜及呼吸抑制。不同個體之間μ-阿片受體基因的表達(dá)水平有差異，對疼痛刺激的反應(yīng)也有差異，對阿片藥物的反應(yīng)也不同。

3、GABAA和NMDA受體

γ-氨基丁酸A型（GABAA）受體是遞質(zhì)門控離子通道，能夠調(diào)節(jié)多種物的效應(yīng)。GABAA受體的亞單位（α、β、γ、δ、ε和θ）的編碼基因存在多態(tài)性（尤其α和β），可能與孤獨(dú)癥、酒精依賴、癲癇及精神分裂癥有關(guān)，但尚未見與物敏感性有關(guān)的報(bào)道。N-甲基-D-天門冬氨酸（NMDA）受體的多態(tài)性也有報(bào)道，但尚未發(fā)現(xiàn)與之相關(guān)的疾病。

（三）基因多態(tài)性對其它調(diào)節(jié)因子的影響

有些蛋白既不是藥物作用的直接靶點(diǎn)，也不影響藥代和藥效動力學(xué)，但其編碼基因的多態(tài)性在某些特定情況下會改變個體對藥物的反應(yīng)。例如，載脂蛋白E基因的遺傳多態(tài)性可以影響羥甲基戊二酸單酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶抑制劑（他汀類藥物）的治療反應(yīng)。鮮紅色頭發(fā)的出現(xiàn)幾乎都是黑皮質(zhì)素-1受體（MC1R）基因突變的結(jié)果。MC1R基因敲除的老鼠對的需求量增加。先天紅發(fā)婦女對地氟醚的需要量增加，熱痛敏上升而局麻效力減弱。

四、苯二氮卓類藥與基因多態(tài)性

大多數(shù)苯二氮卓類藥經(jīng)肝臟CYP45O代謝形成極性代謝物，由膽汁或尿液排出。常用的苯二氮卓類藥物咪唑安定就是由CYP3A代謝，其代謝產(chǎn)物主要是1-羥基咪唑安定，其次是4-羥基咪唑安定。在體實(shí)驗(yàn)顯示不同個體咪唑安定的清除率可有五倍的差異。

地西泮是另一種常用的苯二氮卓類鎮(zhèn)靜藥，由CYP2C19和CYP2D6代謝。細(xì)胞色素CYP2C19的G681A多態(tài)性中A等位基因純合子個體與正常等位基因G純合子個體相比，地西泮的半衰期延長4倍，可能是CYP2C19的代謝活性明顯降低的原因。A等位基因雜合子個體對地西泮代謝的半衰期介于兩者之間。這些基因的差異在臨床上表現(xiàn)為地西泮用藥后鎮(zhèn)靜或意識消失的時間延長[9,10]。

五、吸入與基因多態(tài)性

到目前為止，吸入的藥物基因組學(xué)研究主要集中于尋找引起藥物副反應(yīng)的遺傳方面的原因，其中研究最多的是MH。藥物基因組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)RYR1基因變異與MH密切相關(guān)，現(xiàn)在已知至少有23種不同的RYR1基因多態(tài)性與MH有關(guān)。

與MH不同，氟烷性肝炎可能源于機(jī)體對在CYP2E1作用下產(chǎn)生的氟烷代謝產(chǎn)物的一種免疫反應(yīng)，但其發(fā)生機(jī)制還不十分清楚[7,11]。

六、神經(jīng)肌肉阻滯藥與基因多態(tài)性

神經(jīng)肌肉阻滯藥如琥珀酰膽堿和美維庫銨的作用與遺傳因素密切相關(guān)。血漿中丁酰膽堿酯酶(假性膽堿酯酶)是一種水解這兩種藥物的酶，已發(fā)現(xiàn)該酶超過40種的基因多態(tài)性，其中最常見的是被稱為非典型的（A）變異體，其第70位發(fā)生點(diǎn)突變而導(dǎo)致一個氨基酸的改變，與應(yīng)用肌松劑后長時間窒息有關(guān)。如果丁酰膽堿酯酶Asp70Gly多態(tài)性雜合子(單個等位基因)表達(dá)，會導(dǎo)致膽堿酯酶活性降低，藥物作用時間通常會延長3～8倍；而丁酰膽堿酯酶Asp70Gly多態(tài)性的純合子(2個等位基因)表達(dá)則更加延長其恢復(fù)時間，比正常人增加60倍。法國的一項(xiàng)研究表明，應(yīng)用多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）方法，16例發(fā)生過窒息延長的病人中13例被檢測為A變異體陽性。預(yù)先了解丁酰膽堿酯酶基因型的改變，避免這些藥物的應(yīng)用可以縮短術(shù)后恢復(fù)時間和降低醫(yī)療費(fèi)用[6,12]。

七、鎮(zhèn)痛藥物與基因多態(tài)性

μ-阿片受體是臨床應(yīng)用的阿片類藥的主要作用部位。5%～10%的高加索人存在兩種常見μ-阿片受體基因變異，即A118G和G2172T。A118G變異型使阿片藥物的鎮(zhèn)痛效力減弱。另一種阿片相關(guān)效應(yīng)—瞳孔縮小，在118G攜帶者明顯減弱。多態(tài)性還可影響阿片類藥物

代謝。

阿片類藥物的重要的代謝酶是CYP2D6?？纱蛲ㄟ^CYP2D6轉(zhuǎn)化為它的活性代謝產(chǎn)物－嗎啡，從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。對33名曾使用過曲馬多的死者進(jìn)行尸檢發(fā)現(xiàn)，CYP2D6等位基因表達(dá)的數(shù)量與曲馬多和O－和N－去甲基曲馬多的血漿濃度比值密切相關(guān)，說明其代謝速度受CYP2D6多態(tài)性的影響。除CYP2D6外，美沙酮的代謝還受CYP3A4的作用。已證實(shí)CYP3A4在其它阿片類藥如芬太尼、阿芬太尼和蘇芬太尼的代謝方面也發(fā)揮重要作用。

有報(bào)道顯示兒茶酚O-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)基因與痛覺的產(chǎn)生有關(guān)。COMT是兒茶酚胺代謝的重要介質(zhì)，也是痛覺傳導(dǎo)通路上腎上腺素能和多巴胺能神經(jīng)的調(diào)控因子。研究證實(shí)Val158MetCOMT基因多態(tài)性可以使該酶的活性下降3～4倍。Zubieta等報(bào)道，G1947A多態(tài)性個體對實(shí)驗(yàn)性疼痛的耐受性較差，μ-阿片受體密度增加，內(nèi)源性腦啡肽水平降低[13～16]。

八、局部與基因多態(tài)性

羅哌卡因是一種新型的酰胺類局麻藥，有特有的S-(-)-S對應(yīng)體，主要經(jīng)肝臟代謝消除。羅哌卡因代謝產(chǎn)物3-OH-羅哌卡因由CYP1A2代謝生成，而4-OH-羅哌卡因、2-OH-羅哌卡因和2-6-pipecoloxylidide(PPX)則主要由CYP3A4代謝生成。CYP1A2的基因多態(tài)性主要是C734T和G2964A。Mendoza等對159例墨西哥人的DNA進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)CYP1A2基因的突變率為43%。Murayama等發(fā)現(xiàn)日本人中CYP1A2基因存在6種導(dǎo)致氨基酸替換的SNPs。這些發(fā)現(xiàn)可能對藥物代謝動力學(xué)的研究、個體化用藥具有重要意義[17,18,19]。