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篇（1）

此番銀基牽手茅臺(tái)被業(yè)內(nèi)解讀成豐富產(chǎn)品線，尋找新的盈利增長(zhǎng)點(diǎn)，因?yàn)殂y基2012年中期財(cái)報(bào)披露，其凈虧1.77億港元，有近13億港元的應(yīng)收賬款，營(yíng)收同比下降85.4%。2011年同期，公司收入則高達(dá)16億港元，有4.07億港元的凈利潤(rùn)，這是銀基在香港上市4年以來提交的首份虧損財(cái)報(bào)。這種解讀是正確的，但銀基的虧損僅僅是其與茅臺(tái)合作的誘因，而不是根本原因，根源在于銀基所經(jīng)銷的五糧液系列、國(guó)窖1573系列、汾酒系列海外市場(chǎng)拓展不利，而海外市場(chǎng)拓展不利的根源在這些品牌的酒文化不被國(guó)外市場(chǎng)認(rèn)同。因此，我認(rèn)為銀基牽手茅臺(tái)折射出的是中國(guó)白酒的文化困局。

多年來，中國(guó)白酒拓展海外市場(chǎng)效果很不理想，這是公認(rèn)的事實(shí)。并不是西方人不喝酒，也不是他們不習(xí)慣白酒的口感，而是不認(rèn)可白酒的文化。洋酒在中國(guó)的成功證明了口感不是問題，文化才是根本。

筆者做過幾次市場(chǎng)調(diào)研，喝洋酒的人，65%以上其實(shí)并不認(rèn)為洋酒比白酒更好喝，他們喝洋酒不是沖著其口感，而是文化。比如，在北京經(jīng)常出現(xiàn)這樣的現(xiàn)象：中午在飯店喝白酒，晚上到夜店喝洋酒。如果在夜店喝白酒就會(huì)覺得怪怪的。是文化在背后起了作用。

酒是精神價(jià)值與物理價(jià)值高度統(tǒng)一的特殊商品，與其物理價(jià)值相比，酒的精神價(jià)值更加重要，而所謂的精神價(jià)值，主要是由酒文化構(gòu)建和支撐的。因此，酒類品牌都在致力于打造自己的獨(dú)特酒文化。白酒品牌也不例外。

但事實(shí)上，中國(guó)白酒的酒文化存在致命的缺陷。

一、白酒文化的根是農(nóng)耕文明，不符合工業(yè)化、城市化大潮流

白酒已有幾千年的歷史了，但從儀狄造酒算起，或者從杜康釀酒開始，漫長(zhǎng)的白酒發(fā)展史就是一部農(nóng)耕文明發(fā)展史。在世界上最大規(guī)模農(nóng)耕文明的養(yǎng)育下，中國(guó)白酒積淀起深厚的農(nóng)耕文化氣質(zhì)。這種酒文化滲透到人們生活的方方面面，徹底與中國(guó)人的生活融為了一體。

但今天，中國(guó)進(jìn)行著世界上最大規(guī)模的人口大遷徙，成億的人口從農(nóng)村走進(jìn)城市。中國(guó)經(jīng)濟(jì)的重心也早已從農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)移到工業(yè)，并正在向服務(wù)業(yè)轉(zhuǎn)移。同時(shí)，我們正趕上第三次工業(yè)革命，這次科技革命不僅極大地推動(dòng)了人類社會(huì)經(jīng)濟(jì)、政治、文化領(lǐng)域的變革，而且也影響了人類生活方式和思維方式，使人類社會(huì)生活和人的現(xiàn)代化向更高境界發(fā)展。同時(shí)，第三次工業(yè)革命讓世界變成了地球村，信息融通更加便捷。在這樣的時(shí)代大背景下，統(tǒng)治中國(guó)的文明正由或者已經(jīng)由農(nóng)業(yè)文明變?yōu)楣I(yè)文明，由農(nóng)村文明變?yōu)槎际形拿鳌?/p>

做企業(yè)的都知道一個(gè)基本原則：隨需而變。不同的文明孕育不同的文化，時(shí)代變了，市場(chǎng)需求自然也發(fā)生了變化，白酒文化自然也應(yīng)該隨之而變。但事實(shí)上，絕大部分的白酒企業(yè)依然走在農(nóng)耕文明的老路上，依然在挖掘歷史，依然試圖用幾百年前乃至幾千年前的歷史人物或故事去征服今天的消費(fèi)者，在國(guó)內(nèi)這么做，在國(guó)外仍然這么做。落后的文明自然會(huì)遭到先進(jìn)文明的強(qiáng)烈排斥和打壓，所以中國(guó)的白酒很難受到西方社會(huì)的認(rèn)可。其實(shí)這點(diǎn)道理很容易想明白，即便僅僅是國(guó)內(nèi)市場(chǎng)也早已經(jīng)給了我們清晰的答案：文化修養(yǎng)越低的人白酒的消費(fèi)量越大，文化修養(yǎng)越高的人白酒的消費(fèi)量越小，白酒的消費(fèi)量與消費(fèi)者的文化修養(yǎng)正好成反比，這就是對(duì)我上面所言的最好證明。

說到這里，我們就很容易理解為什么綜合素養(yǎng)越高的人越熱衷于洋酒和葡萄酒了。同時(shí)，我們也就不難理解為什么白酒企業(yè)的營(yíng)銷總是那么粗放和笨拙了。根本上來說，白酒在國(guó)際市場(chǎng)上的失利是酒文化的失利，而不是口感、渠道和價(jià)格的失利。

二、白酒文化缺乏時(shí)尚基因

白酒表面的喧嘩掩蓋不了其守舊的本質(zhì)，固守過去就意味著對(duì)現(xiàn)在的放棄，而現(xiàn)在就是與時(shí)俱進(jìn)，就是時(shí)尚。

毫無疑問，這是一個(gè)比以往任何時(shí)候都更強(qiáng)調(diào)時(shí)尚的年代。追隨時(shí)代的步伐，透析當(dāng)下人們的價(jià)值觀，并用產(chǎn)品和品牌去迎合和滿足這種價(jià)值觀需求，這就是時(shí)尚。在都市文明占統(tǒng)治地位的時(shí)代，在個(gè)性化成為標(biāo)簽的時(shí)代，白酒依然用農(nóng)耕思維做產(chǎn)品和品牌，不懂時(shí)尚、不夠時(shí)尚就是必然的了。

說到這里很多白酒企業(yè)會(huì)很不服氣，特別是那些銷量巨大的品牌。其實(shí)從白酒的產(chǎn)品和品牌傳播中是很容易看到不夠時(shí)尚這一缺陷的。

白酒的產(chǎn)品包裝一個(gè)比一個(gè)奢華，但這種奢華總是透射著封建社會(huì)的審美觀，總是帶有強(qiáng)烈的暴發(fā)戶的痕跡，生硬而膚淺。顯得與時(shí)代格格不入。

品牌傳播不是注重品牌文化的體驗(yàn)，而是過分依賴廣告投入，依賴高度同質(zhì)化的促銷，依賴不太體面的買店等惡性手段。而時(shí)尚恰恰是一種身心體驗(yàn)，而不是廣告和促銷所能引導(dǎo)的。

這些都導(dǎo)致了極其嚴(yán)重的同質(zhì)化競(jìng)爭(zhēng)。

時(shí)尚和個(gè)性是一個(gè)硬幣的兩面，一個(gè)懂得時(shí)尚的品牌必然是一個(gè)充滿個(gè)性的品牌，而時(shí)尚和個(gè)性恰恰是同質(zhì)化競(jìng)爭(zhēng)的天敵。要想讓品牌具備時(shí)尚和個(gè)性氣質(zhì)，必然要走差異化的競(jìng)爭(zhēng)路線，就像芝華士和黑牌、馬爹利和軒尼詩(shī)一樣。

不夠時(shí)尚的白酒為什么在國(guó)內(nèi)還能如此暢銷？這個(gè)問題很好回答：一方面是幾千年的消費(fèi)慣性在起作用，這種慣性不是短期內(nèi)能徹底改變的；一方面是有很大一批人處于兩種文明的過渡真空期，這批人還沒有形成或正在形成新的價(jià)值觀，對(duì)時(shí)尚并沒有什么深刻的理解，因此，白酒是否時(shí)尚對(duì)他們影響也不大。

三、不少企業(yè)對(duì)酒文化的理解有方向性偏差

不管大事小事，要想把事情做好，首先得理解這個(gè)事情的基本概念。比如想把人做好，就得理解人是什么，人為什么活著；想把品牌做好，就得搞明白品牌是什么，品牌對(duì)企業(yè)的價(jià)值是什么。同樣，想打造極具市場(chǎng)影響力的酒文化，就得弄明白酒文化到底是什么，和消費(fèi)者有什么關(guān)系，這種關(guān)系是怎樣發(fā)生的。太多的企業(yè)認(rèn)為這些問題過于簡(jiǎn)單而不去深入思考，恰恰是這種漠視，影響了企業(yè)對(duì)酒文化的判斷和理解，最后出現(xiàn)方向性偏差。

誤將酒文化等同于品牌文化

白酒的酒文化是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，包含了太多的東西，但只有一個(gè)點(diǎn)是和消費(fèi)者發(fā)生著直接的關(guān)系，就是酒文化所代表的價(jià)值觀，這個(gè)嚴(yán)格意義上來說應(yīng)該是品牌文化。品牌文化和酒文化最大的區(qū)別是：品牌文化是個(gè)市場(chǎng)化概念，它生發(fā)于消費(fèi)者內(nèi)心，是基于營(yíng)銷和競(jìng)爭(zhēng)而生的；酒文化卻不那么單純，其構(gòu)成的復(fù)雜性決定了它往往脫離市場(chǎng)而成為一種空幻的概念。

在賣方市場(chǎng)下可以不考慮品牌，因?yàn)橄M(fèi)者沒得選擇。但在買方市場(chǎng)下，不考慮品牌只有死路一條。在對(duì)品牌的理解上，白酒業(yè)與軟飲料、電子、汽車等行業(yè)有著很大的差距。厘清品牌文化與酒文化之間的關(guān)系應(yīng)該是白酒企業(yè)的首要任務(wù)。

誤把釀造文化等同于品牌文化

釀造文化生發(fā)于生產(chǎn)，而品牌文化生發(fā)于市場(chǎng)，這是完全反方向的兩個(gè)東西。我們看到不少企業(yè)喜歡拿釀造文化混同于品牌文化，最典型的就是搞出越來越多的香型。事實(shí)已經(jīng)證明，這些花里胡哨的香型并不被市場(chǎng)買賬。消費(fèi)者關(guān)注的焦點(diǎn)并不是你的酒是怎么釀造出來的，而是你的酒是不是稱了他的心，也就是你的品牌是不是和他有共同語言，價(jià)值觀是否相同。釀造文化可以作為品牌文化的支撐點(diǎn)之一，用以幫助消費(fèi)者更好的理解品牌文化，但絕不能等同于品牌文化，這將會(huì)給企業(yè)發(fā)展帶來巨大阻礙。

誤把歷史等同于品牌文化

把歷史等同于品牌文化是白酒業(yè)的又一大特色。在中國(guó)，掘歷史的墳?zāi)棺顝氐椎牟皇切≌f家，不是電影人，不是史學(xué)家，而是白酒企業(yè)。不管大小，每一個(gè)白酒企業(yè)都能說出一大堆的歷史故事。但真正能流傳開來的卻極少極少，如果放到大眾消費(fèi)者身上，能流傳的白酒故事恐怕也只有“李白斗酒詩(shī)百篇、牧童遙指杏花村”等進(jìn)了教科書的可憐的幾個(gè)了吧。

歷史的車輪是滾滾向前的，關(guān)注今天和明天是人們的常性，關(guān)注過去只是生活的附帶，即使僅僅是附帶的回顧一下歷史，也是為了更加清楚的認(rèn)識(shí)現(xiàn)在和未來。如果一個(gè)企業(yè)把歷史當(dāng)做自己關(guān)注的主要焦點(diǎn)，必然會(huì)忽略對(duì)現(xiàn)在和未來的解讀。這或許是白酒品牌多缺乏時(shí)尚感和國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力的根源吧。

篇（2）

1引言

轉(zhuǎn)鐵蛋白（Trf）是脊椎動(dòng)物體中一種非血紅素結(jié)合鐵的馇虻鞍祝捎胂赴ど系rf受體結(jié)合，內(nèi)吞化形成內(nèi)吞小體。在特定信號(hào)介導(dǎo)下，Trf可以通過釋放鐵離子，轉(zhuǎn)移出細(xì)胞膜外。由于惡性腫瘤細(xì)胞過度表達(dá)Trf受體，因此，通過標(biāo)記Trf可進(jìn)行腫瘤細(xì)胞的識(shí)別、診斷和治療研究[1，2]。量子點(diǎn)作為一種新型熒光材料，近年來在生物成像研究中快速發(fā)展，特別是在細(xì)胞可視化研究方面[3～11]。量子點(diǎn)用于細(xì)胞標(biāo)記一般需將量子點(diǎn)與靶蛋白偶聯(lián)，再通過靶蛋白結(jié)合在細(xì)胞膜或進(jìn)入胞內(nèi)顯示量子點(diǎn)的熒光，由此進(jìn)行靶蛋白在細(xì)胞膜及胞內(nèi)的定位及成像分析。因此靶蛋白與量子點(diǎn)的偶聯(lián)體系的構(gòu)建是量子點(diǎn)生物成像應(yīng)用的基礎(chǔ)。

本研究選取Trf為靶蛋白，通過其與細(xì)胞膜上的Trf受體結(jié)合，進(jìn)而轉(zhuǎn)運(yùn)靶蛋白量子點(diǎn)的偶聯(lián)物。目前，量子點(diǎn)與蛋白質(zhì)的偶聯(lián)多采用生物素親和素法、共價(jià)法及靜電吸附法等。蛋白質(zhì)與量子點(diǎn)偶聯(lián)時(shí)，二者的混合比例決定偶聯(lián)產(chǎn)物的質(zhì)量以及生物功能化的效果。在量子點(diǎn)與蛋白質(zhì)的偶聯(lián)反應(yīng)中建立高效、快速、低成本方法進(jìn)行表征，對(duì)于偶聯(lián)體系的優(yōu)化，提高偶聯(lián)效率非常必要。本研究利用毛細(xì)管電泳激光誘導(dǎo)熒光法（CELIF）的高效、快速、高靈敏和樣品用量少等優(yōu)勢(shì)，對(duì)Trf與量子點(diǎn)CdTe偶聯(lián)的方法和條件進(jìn)行快速優(yōu)化，并將得到的CdTeTrf偶聯(lián)物不經(jīng)分離而直接用于Hela細(xì)胞標(biāo)記。通過激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行標(biāo)記效果的成像觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， CdTeTrf偶聯(lián)物具有Trf的生物功能，并能特異性識(shí)別細(xì)胞膜表面的Trf受體，在其介導(dǎo)下可轉(zhuǎn)運(yùn)到Hela細(xì)胞內(nèi)，分布在胞質(zhì)中。CELIF法也適用于其它熒光納米材料的表面功能化效率表征，包括偶聯(lián)劑種類的選擇和反應(yīng)比例的優(yōu)化、偶聯(lián)產(chǎn)物的性質(zhì)表征等，具有一定的通用性。

3結(jié)果與討論

采用CELIF進(jìn)行偶聯(lián)條件優(yōu)化可得到偶聯(lián)產(chǎn)物的定性與定量信息，如荷電性質(zhì)、荷質(zhì)比、熒光強(qiáng)度、穩(wěn)定性等，有助于最佳條件的判斷和選擇。

3.1偶聯(lián)劑活化后量子點(diǎn)的表征

因所用量子點(diǎn)是以巰基乙酸為穩(wěn)定劑在水相中合成而得，故量子點(diǎn)表面包覆著一層羧基，而量子點(diǎn)與Trf的偶聯(lián)則通過量子點(diǎn)表面的羧基與蛋白質(zhì)表面的氨基間的酰胺反應(yīng)完成。NHS和EDC為常用的亞胺偶聯(lián)劑，實(shí)驗(yàn)中對(duì)比了以NHS及NHS和EDC混合偶聯(lián)劑（EDCNHS）活化的量子點(diǎn)性能（圖1）。

由圖1a可見，以單一偶聯(lián)劑NHS活化的量子點(diǎn)其熒光強(qiáng)度高且峰形尖銳，說明單一偶聯(lián)劑NHS活化的量子點(diǎn)粒徑均一，有利于減少量子點(diǎn)表面缺陷，增強(qiáng)量子點(diǎn)熒光效率。當(dāng)使用混合偶聯(lián)劑活化時(shí)，量子點(diǎn)的峰形較寬，峰強(qiáng)度較低（圖1b），說明混合偶聯(lián)劑可能導(dǎo)致量子點(diǎn)的穩(wěn)定性降低，量子點(diǎn)間產(chǎn)生一定程度的團(tuán)聚。導(dǎo)致其峰高降低，峰展寬。對(duì)比圖1a和圖1b可見，單一偶聯(lián)劑NHS活化后量子點(diǎn)性能好于混合偶聯(lián)劑EDCNHS活化的量子點(diǎn)。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用NHS偶聯(lián)劑對(duì)量子點(diǎn)進(jìn)行活化[12，14]。

3.2量子點(diǎn)偶聯(lián)Trf的條件優(yōu)化

NHS的存在使Trf可有效的偶聯(lián)于CdTe表面，形成類似核殼結(jié)構(gòu)的CdTeTrf偶聯(lián)產(chǎn)物。由圖2A第一個(gè)電泳圖可見，產(chǎn)物峰（3.3 min）相對(duì)于活化后的CdTe（圖1a， 6.3 min）遷移時(shí)間縮短，即量子點(diǎn)偶聯(lián)蛋白后遷移加快，說明Trf確實(shí)已偶聯(lián)于CdTe表面，且偶聯(lián)產(chǎn)物表面電荷性質(zhì)以及整體的荷質(zhì)比更接近于蛋白質(zhì)的遷移時(shí)間（約3.0 min）。因此說明不同Trf濃度下形成的偶聯(lián)產(chǎn)物均以CdTe為核，以Trf為殼，呈現(xiàn)為核殼復(fù)合物。

隨偶聯(lián)蛋白Trf濃度的增加，偶聯(lián)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度變化如圖2B。當(dāng)Trf的濃度低于31.2 olL時(shí)，隨Trf的濃度增加，偶聯(lián)產(chǎn)物熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。說明包覆于表面的Trf對(duì)CdTe表面的晶格缺陷有所改善。Trf的包覆量越多，CdTe表面越完善，熒光強(qiáng)度越高。但當(dāng)Trf濃度高于31.2 olL，熒光強(qiáng)度轉(zhuǎn)而開始下降。說明偶聯(lián)反應(yīng)在31.2 olL時(shí)已達(dá)飽和，CdTe表面完全被Trf包覆，而溶液中過量的游離Trf不僅對(duì)功能化的量子點(diǎn)有一定的熒光猝滅作用，而且在后續(xù)偶聯(lián)體系標(biāo)記細(xì)胞時(shí)，游離的Trf將與偶聯(lián)產(chǎn)物CdTeTrf一起競(jìng)爭(zhēng)細(xì)胞上的Trf受體靶標(biāo)，嚴(yán)重干擾CdTeTrf對(duì)細(xì)胞表面Trf受體的標(biāo)記。因此，采用CELIF法對(duì)量子點(diǎn)偶聯(lián)條件進(jìn)行優(yōu)化，簡(jiǎn)單快速，可明確判斷蛋白質(zhì)是否偶聯(lián)于量子點(diǎn)表面，更有利于嚴(yán)格控制Trf與CdTe的反應(yīng)比例，提高偶聯(lián)效率和細(xì)胞標(biāo)記效果，后續(xù)標(biāo)記時(shí)不需要對(duì)偶聯(lián)體系的產(chǎn)物進(jìn)行分離純化。由于Trf濃度增高，會(huì)使溶液粘度增加，導(dǎo)致電泳峰展寬，因此采用峰面積考察熒光強(qiáng)度變化。

篇（3）

研究目的：本研究擬在大腸桿菌中表達(dá)FimA蛋白并進(jìn)行蛋白純化。為后續(xù)實(shí)驗(yàn)制備抗FimA蛋白的多克隆抗體提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

研究方法：1. 以大腸桿菌BL21(DE3)pLysS為宿主菌，用IPTG誘導(dǎo)fimA表達(dá)，通過SDS-PAGE和Western blot來驗(yàn)證蛋白的表達(dá)結(jié)果，并進(jìn)行蛋白表達(dá)形式分析。2. 大量誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白，用Co2+柱親和層析純化表達(dá)產(chǎn)物，通過SDS-PAGE和Western blot來驗(yàn)證純化產(chǎn)物，純化產(chǎn)物經(jīng)透析復(fù)性后用BCA法蛋白定量試劑盒作蛋白含量測(cè)定。

研究結(jié)果：1. 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，工程菌在SDS-PAGE上出現(xiàn)一條新蛋白帶，分子量與預(yù)期大小基本一致（約41kDa），IPTG濃度及誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)融合蛋白表達(dá)量影響較大：當(dāng)IPTG濃度為2 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間為3 h時(shí)蛋白表達(dá)量最大；當(dāng)IPTG濃度為1 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間為1 h時(shí)蛋白表達(dá)量最小。6×His-FimA表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，X線片感光，在X線片上相應(yīng)位置呈現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，可見一明顯蛋白條帶，而空質(zhì)粒pET-15b對(duì)應(yīng)位置未見特異條帶。蛋白表達(dá)形式分析結(jié)果表明表達(dá)的融合蛋白位于包涵體中。2. 表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Co2+柱親和層析， SDS-PAGE上出現(xiàn)一致的單一條帶，其分子量大小與預(yù)期相符（約41kDa）。6×His-FimA純化產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，X線片感光，在X線片上相應(yīng)位置呈現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，可見一明顯蛋白條帶，條帶位置與BL21(DE3)pLysS全菌誘導(dǎo)表達(dá)后相應(yīng)蛋白位置一致。經(jīng)BCA法蛋白濃度定量試劑盒對(duì)純化后的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析，計(jì)算出純化后的FimA蛋白濃度為0.96 mg/ml。

主要結(jié)論：用本課題組前期構(gòu)建的fimA基因的原核表達(dá)質(zhì)粒pET-15b-fimA，在大腸桿菌BL21(DE3)pLysS中誘導(dǎo)表達(dá)后，fimA基因能夠得到正確表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Co2+柱親和層析，可以得到帶6×His標(biāo)簽的FimA融合蛋白。

1 緒論

慢性牙周炎是導(dǎo)致成人牙齒功能喪失的主要原因之一，在我國(guó)有很高的發(fā)病率，嚴(yán)重影響國(guó)民健康水平。牙周炎造成的牙周組織的破壞是持續(xù)性的，一旦發(fā)生，目前的治療手段還不能使牙周組織達(dá)到完全的恢復(fù)。牙周炎還可能是某些系統(tǒng)性疾病的危險(xiǎn)因素。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、人民生活水平的提高和人群壽命的延長(zhǎng)，對(duì)牙周健康狀況的關(guān)注日益提高。因此，探索預(yù)防慢性牙周炎的有效途徑對(duì)于提高國(guó)民健康水平具有重要意義。

疫苗在人和家畜疾病防治方面具有極大的作用，是一種有效的防治疾病的手段。從減毒活疫苗、死疫苗、亞單位疫苗、重組疫苗到DNA疫苗，由于技術(shù)不斷改進(jìn)，使得疫苗有了廣泛的應(yīng)用，被成功的用于許多細(xì)菌或病毒感染的防治，因此以疫苗來防治牙周炎也已成為一個(gè)重要思路。

慢性牙周炎是一種細(xì)菌感染性疾病，牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis， Pg)是其主要可疑致病菌[1]。菌毛是Pg表面主要毒力因子之一，菌毛蛋白(fimbrillin，F(xiàn)imA)是其主要亞單位，能夠介導(dǎo)Pg對(duì)宿主組織的粘附與入侵，以及與口內(nèi)其他細(xì)菌的粘附共聚[1-3]，還能刺激炎性因子的產(chǎn)生[4]。多菌毛Pg野生型菌株可引起定菌大鼠牙槽骨吸收，而無菌毛的突變菌株則不會(huì)造成牙槽骨的破壞。也有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用FimA免疫大鼠可減輕由Pg引起的牙槽骨破壞[5]，將抗FimA的單克隆抗體用于口腔被動(dòng)免疫，可以抑制該菌在口腔的定植[6]。因此，可以將FimA作為防治牙周炎疫苗抗原。

Pg菌毛的單體是FimA，由單拷貝fimA基因編碼。fimA基因全長(zhǎng)1290 bp，開放讀框包括1044 bp，編碼347個(gè)氨基酸。翻譯后產(chǎn)物菌毛蛋白的功能域（如刺激T細(xì)胞和B細(xì)胞的位點(diǎn)、刺激細(xì)胞因子產(chǎn)生的位點(diǎn)等）位于氨基酸序列的31～331aa不等，各個(gè)位點(diǎn)之間可相互交叉或覆蓋。近年來由于分子生物學(xué)和免疫學(xué)的發(fā)展，fimA基因已被克隆和測(cè)序，對(duì)蛋白質(zhì)分子中的各個(gè)功能區(qū)、抗原表位已有了更深入的了解，為研制疫苗提供了可靠的依據(jù)。

根據(jù)國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展，在前期已構(gòu)建fimA原核表達(dá)質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，本研究擬在大腸桿菌BL21（DE3）pLysS中表達(dá)FimA融合蛋白，并通過金屬螯合親和層析技術(shù)進(jìn)行純化，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)制備抗FimA蛋白的多克隆抗體、研發(fā)用于人類的、可有效防治牙周炎的DNA疫苗提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

2 文獻(xiàn)回顧

牙周炎是口腔疾病中的常見病和多發(fā)病，在我國(guó)有很高的發(fā)病率[7]。牙周炎累及牙齒數(shù)目多，預(yù)后差，是造成牙齒缺失的主要原因。隨著我國(guó)進(jìn)入老齡化社會(huì)，牙周炎的預(yù)防將成為突出的保健問題。世界衛(wèi)生組織已將牙周組織健康列為健康人的十項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)之一[7]。探索預(yù)防和治療這種嚴(yán)重危害人類口腔健康的疾病的方法，對(duì)于改善我國(guó)人民的口腔健康水平，提高人們的生活質(zhì)量有著重要意義。

大量的實(shí)驗(yàn)研究、流行病學(xué)資料和臨床觀察表明[7]，牙周炎是菌斑微生物引起的感染性疾病。菌斑微生物是引發(fā)牙周炎的始動(dòng)因子，是造成牙周組織破壞的必須因素。牙周菌斑中絕大多數(shù)細(xì)菌為口腔固有菌叢，對(duì)宿主無不良影響，僅少數(shù)細(xì)菌與牙周炎的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。其中牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis， Pg）是目前獲得公認(rèn)的一種牙周致病菌，它是牙周病，尤其是成人慢性牙周炎病變區(qū)或活動(dòng)部位最主要的優(yōu)勢(shì)病原菌，而健康齦溝內(nèi)很少[7， 8]。目前牙齦卟啉單胞菌也是牙周微生物學(xué)領(lǐng)域重點(diǎn)研究的厭氧菌之一。除口腔疾病外，在全身系統(tǒng)性疾病的研究中，血清學(xué)、動(dòng)物模型、細(xì)胞培養(yǎng)的研究證實(shí)[9-11] Pg感染與心腦血管疾病的發(fā)生有關(guān)，而且有學(xué)者報(bào)道[12]Pg的感染與低體重嬰兒的分娩也有關(guān)。

Pg含有大量毒性因子，如蛋白酶、菌毛、脂多糖、血凝素等。其中菌毛在牙周致病作用中占據(jù)重要地位，而且與Pg在口腔的定植有關(guān)，為Pg的優(yōu)勢(shì)抗原之一。另外，因其具有廣泛的生物學(xué)活性而成為牙齦卟啉單胞菌研究的一個(gè)熱點(diǎn)。

菌毛（pili，fimbriae）是位于革蘭氏陰性菌Pg菌體表面的一種彎曲的、單股的絲狀物，長(zhǎng)0.3～1.0 μm，直徑為3.5～5.0 nm，遍布細(xì)菌表面，多者每菌可有數(shù)百根，由菌體表面伸向細(xì)胞外。其化學(xué)組分是一種蛋白質(zhì)，與細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)無關(guān)。

2.1 菌毛的致病機(jī)制 2.1.1 介導(dǎo)Pg附著于口腔

Pg附著于宿主組織表面是其定植于口腔的關(guān)鍵，也是其致病的先決條件。Pg可選擇性的直接附著于口腔內(nèi)特定部位組織的表面，或識(shí)別已經(jīng)附著在組織表面的細(xì)菌，然后間接的附著于組織表面。

1）菌毛可介導(dǎo)Pg附著于口腔內(nèi)各種組織細(xì)胞的表面

菌毛可介導(dǎo)Pg黏附于齦溝液中的成分（如人血紅蛋白和纖維蛋白原）；唾液中的重要蛋白質(zhì)成分（如富脯蛋白PRP、富脯糖蛋白PRG、富酪蛋白PRT）；乳鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白（ECM）（如玻連蛋白和纖維連接蛋白）。人細(xì)胞外基質(zhì)蛋白通過與FimA受體配體的結(jié)合在細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。菌毛對(duì)基質(zhì)蛋白有很強(qiáng)的親和力，而且明顯抑制玻連蛋白/纖維連接蛋白與其受體αβ3和配體α5β（在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢CHO細(xì)胞株中過度表達(dá)）的相互結(jié)合。在牙周組織中，菌毛可能通過細(xì)胞外基質(zhì)蛋白受體/配體途徑阻斷細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

菌毛還可介導(dǎo)Pg黏附于牙齦上皮細(xì)胞、牙周袋上皮細(xì)胞、人口腔上皮細(xì)胞、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，附著并凝集人或羊的紅細(xì)胞等。Umemoto[13]構(gòu)建了無菌毛的Pg突變株，發(fā)現(xiàn)其對(duì)人口腔上皮癌細(xì)胞的黏附性和侵襲性均降低，接種小鼠后引起牙槽骨喪失的量也減少。其他學(xué)者構(gòu)建了不表達(dá)菌毛的Pg缺陷株，發(fā)現(xiàn)它們黏附和侵襲人牙齦成纖維細(xì)胞[14]、上皮細(xì)胞[15]、內(nèi)皮細(xì)胞[16]和樹突狀細(xì)胞[17]的能力也降低，甚至不能黏附。這些研究結(jié)果說明菌毛在Pg黏附于口腔上皮細(xì)胞的過程中起重要作用。

此外，研究發(fā)現(xiàn)Pg可黏附于唾液覆蓋的羥基磷灰石（hydroxyapatite coated with saliva，sHAP），這種黏附活動(dòng)常被作為研究Pg與口腔內(nèi)唾液覆蓋的各種組織細(xì)胞黏附活動(dòng)的模型。Lee[18]等的研究發(fā)現(xiàn)，Pg與羥基磷灰石之間的這種黏附活動(dòng)需要菌毛參與，而且抗菌毛的抗體能完全抑制這種黏附作用。學(xué)者們[14， 16]通過同源重組技術(shù)滅活fimA基因后，發(fā)現(xiàn)突變株與sHAP的黏附能力降低。這些研究結(jié)果提示FimA菌毛蛋白在Pg黏附到唾液覆蓋的口腔內(nèi)各種組織表面的過程中起重要作用。

2）在菌斑形成的早期，菌毛可介導(dǎo)Pg黏附于附著在獲得性膜表面的細(xì)菌，間接的附著于組織表面

細(xì)菌之間的相互黏附和共聚有助于早期生物膜的形成。鏈球菌是最先定植于牙齒表面的主要細(xì)菌，Pg通過菌毛與鏈球菌細(xì)胞表面的甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）高親合力、高特異性的結(jié)合而與鏈球菌發(fā)生共聚，這種相互作用在Pg定植于牙周袋的過程中可能起重要作用。此外菌毛還參與Pg與放線菌、福賽氏類桿菌之間的黏附過程。

3）有關(guān)黏附機(jī)制的研究

現(xiàn)在已經(jīng)明確Pg黏附于口腔的過程為一種特異性識(shí)別過程，菌毛可能為特異性配體，與宿主細(xì)胞膜上的特異性受體相互作用[7]。部分Pg菌毛可識(shí)別的黏附受體現(xiàn)已明確，如βintegrins[7，19]、上皮細(xì)胞的細(xì)胞角蛋白14[20]、巨噬細(xì)胞（MCs）上的TLR2和CD14[7]。菌毛通過上皮細(xì)胞的βintegrins促進(jìn)Pg與牙齦上皮細(xì)胞的黏附，抗βintegrins的抗體能抑制Pg的黏附和侵襲[19]。Pg菌毛通過單核細(xì)胞上的TLR2、CD14和CD11a/CD18，誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞IL-6 mRNA的產(chǎn)生、細(xì)胞因子的分泌、p38促有絲分裂蛋白激酶磷酸化和NF-κB的活化。小鼠腹膜巨噬細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究表明，β2 integrins（CD11/CD18）是小鼠腹膜巨噬細(xì)胞與Pg菌毛黏附的細(xì)胞受體；而且β鏈（CD18）在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起關(guān)鍵作用。

綜上所述，菌毛可介導(dǎo)Pg黏附于齦溝液中的成分（如人血紅蛋白和纖維蛋白原）；人唾液成分（如富脯蛋白PRP、富脯糖蛋白PRG）；乳鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白；宿主細(xì)胞（如牙齦上皮細(xì)胞、牙周袋上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，巨噬細(xì)胞等）；口腔內(nèi)的細(xì)菌（如鏈球菌、放線菌、福賽氏類桿菌）。借助于菌毛黏附于這些物質(zhì)，Pg可在口腔內(nèi)進(jìn)一步定植、侵襲、誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

2.1.2 引發(fā)炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)

Pg附著于口腔內(nèi)組織細(xì)胞后，其抗原成分和毒性產(chǎn)物等可引發(fā)白細(xì)胞的趨化、吞噬等炎癥過程，造成表面組織的損傷——其中Pg菌毛能與脂多糖一起激活宿主的防御機(jī)制、誘導(dǎo)多種炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生；此外細(xì)菌及其產(chǎn)物還通過上皮細(xì)胞或者細(xì)胞間質(zhì)進(jìn)入表層下組織，在組織內(nèi)繁殖，甚至擴(kuò)散至全身。

1）Pg菌毛的白細(xì)胞趨化作用

牙周炎再現(xiàn)了一種重要的中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的破壞宿主組織細(xì)胞的模型。牙周炎的優(yōu)勢(shì)病原菌P生的毒力因子主要就是用于調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞的反應(yīng)。其中Pg菌毛能誘導(dǎo)多種可趨化白細(xì)胞至炎癥部位的細(xì)胞因子的分泌。

Pg菌毛可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)趨化因子IL-8（Interleukin-8）和單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1）：感染了野生型Pg的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞持續(xù)低劑量的表達(dá)IL-8和MCP-1，而Pg的fimA基因突變株則不能誘導(dǎo)IL-8和MCP-1產(chǎn)生。同時(shí)，抗菌毛的特異性抗體也能阻斷上述因子的產(chǎn)生。這些提示IL-8和MCP-1的產(chǎn)生是由菌毛特異性引起的。

IL-8和MCP-1都是誘導(dǎo)白細(xì)胞到免疫反應(yīng)部位的有效的趨化因子。MCP-1又稱單核細(xì)胞趨化激活因子（monocyte chemoattractant activating factor， MCAF），它作為趨化因子超家族的一個(gè)主要成員，可以由機(jī)體多種細(xì)胞合成和分泌（如人牙齦上皮細(xì)胞），是重要的炎性細(xì)胞因子，在機(jī)體對(duì)入侵的病原微生物的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)中，起重要調(diào)節(jié)作用。MCP-1的主要生理作用是特異性的趨化中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞向炎癥部位聚集， 同時(shí)還有激活巨噬細(xì)胞的功能。而且炎癥部位的細(xì)胞因子如IL-1、TNF-α等可以刺激機(jī)體的免疫細(xì)胞及其他細(xì)胞表達(dá)MCP-1，該過程中所產(chǎn)生的MCP-1能進(jìn)一步特異性的趨化巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞向病損部位聚集。中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞向炎癥部位聚集，是炎癥反應(yīng)中的一個(gè)重要過程。巨噬細(xì)胞是參與牙槽骨代謝的重要的免疫細(xì)胞，被激活的巨噬細(xì)胞能產(chǎn)生大量的骨吸收性細(xì)胞因子。也有學(xué)者認(rèn)為巨噬細(xì)胞是破骨細(xì)胞的前體細(xì)胞，在破骨細(xì)胞分化因子的存在下，體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞可以向破骨細(xì)胞分化。而牙槽骨的吸收是牙周病的一個(gè)重要病理特點(diǎn)，是病變進(jìn)程、發(fā)展和愈后的一個(gè)重要指標(biāo)。這些提示Pg菌毛能通過免疫細(xì)胞及其他細(xì)胞產(chǎn)生的MCP-1間接的趨化巨噬細(xì)胞向炎癥部位聚集，增加破骨細(xì)胞的數(shù)量，促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化和成熟，進(jìn)而促進(jìn)牙槽骨的吸收。

Pg菌毛可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)粘附分子ICAM-1、VCAM-1和選擇素（selectin）：Pg菌毛誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞內(nèi)黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）、血管細(xì)胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）以及P-selectin/E-selectin。而且加入按照人工合成的菌毛氮末端氨基酸序列多肽能上調(diào)上述分子的表達(dá)，而Pg 的fimA基因突變株或含有抗Pg菌毛蛋白抗體的血清與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，不能誘導(dǎo)上述分子的表達(dá)。

內(nèi)皮細(xì)胞通過上述分子selectin，ICAM-1和VCAM-1可誘導(dǎo)和趨化血液循環(huán)中的白細(xì)胞黏附至內(nèi)皮細(xì)胞。其中選擇素是血管粘附分子大家族中的一大類成員，根據(jù)表達(dá)部位可分為三類[21]：表達(dá)于活化的內(nèi)皮細(xì)胞表面的E-selectin；表達(dá)于白細(xì)胞表面的L-selectin；表達(dá)于活化的血小板和內(nèi)皮細(xì)胞表面的P-selectin。在感染以及其他炎性反應(yīng)發(fā)生過程中，selectin通過與其相應(yīng)配體結(jié)合介導(dǎo)白細(xì)胞（中性粒細(xì)胞、T-和B-淋巴細(xì)胞以及單核細(xì)胞等）與血管壁（特別是毛細(xì)血管后靜脈）接觸，并使白細(xì)胞在血管壁上緩慢滾動(dòng)，從而啟動(dòng)一系列反應(yīng)，最終導(dǎo)致白細(xì)胞在炎性反應(yīng)區(qū)域集中。ICAM-1也可促進(jìn)白細(xì)胞黏附、移動(dòng)和趨化至炎癥部位。血液循環(huán)中的單核細(xì)胞和白細(xì)胞黏附和趨化至內(nèi)皮細(xì)胞，然后穿過內(nèi)皮細(xì)胞在局部聚集是炎癥反應(yīng)的重要過程。Pg菌毛通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞所表達(dá)的selectin、VCAM-1和ICAM-1，趨化單核細(xì)胞和白細(xì)胞至炎癥反應(yīng)的局部，可能在牙周病中起重要作用。

2）Pg菌毛誘導(dǎo)多種炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生

（1）Pg菌毛誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和化學(xué)趨化因子IL-8，誘導(dǎo)p38促有絲分裂蛋白激酶磷酸化，刺激單核細(xì)胞誘導(dǎo)的細(xì)胞核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）p50和p65亞單位的活化（通過TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑），從而誘導(dǎo)高滴度的NF-κB依賴性細(xì)胞因子的釋放。NF-κB是細(xì)胞中一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，是Rel家族的成員，幾乎存在于所有細(xì)胞中，在免疫反應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞凋亡及病毒復(fù)制的調(diào)節(jié)中起主導(dǎo)作用，可在炎癥部位高度表達(dá)，提示其在免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。受NF-κB調(diào)節(jié)的炎性細(xì)胞因子有：腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF-α和TNF-β）；粘附分子（ICAM-1，VCAM，E-selectin）；白介素（IL-1，IL-2，IL-6，IL-8，IL-12）；集落刺激因子（CSF）（粒細(xì)胞-CSF，粒細(xì)胞和單細(xì)胞-CSF）；β-干擾素（INF-β）等。因此，NF-κB是多種促炎癥基因高度轉(zhuǎn)錄的必須因子。同時(shí)，由NF-κB調(diào)節(jié)的產(chǎn)物，如TNF-α和IL-1β又能激活NF-κB，這就意味著存在一個(gè)能放大且延續(xù)炎癥反應(yīng)的復(fù)雜的調(diào)節(jié)環(huán)路。

（2）Pg菌毛還能通過TLR2信號(hào)途徑誘導(dǎo)小鼠腹膜巨噬細(xì)胞產(chǎn)生RANTES、INF-γ、IL-17、VCAM-1、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，誘導(dǎo)MCP-1 mRNA的強(qiáng)表達(dá)。CD18可能在相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制中起重要作用。Pg菌毛可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞株U937表達(dá)IL-1β，IL-8，IL-12和TNF-α。fimA基因正常表達(dá)的Pg菌株能誘導(dǎo)單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞表達(dá)炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6，免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子IL-10和趨化因子IL-8，而fimA基因的突變菌株P(guān)g DPG3就不能誘導(dǎo)上述細(xì)胞因子的表達(dá)。而且用菌毛蛋白刺激單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞，能在自體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR）和自體的CD4+ T細(xì)胞中誘導(dǎo)以IFN-γ為主要細(xì)胞因子的Th1-型免疫反應(yīng)。

關(guān)于菌毛誘導(dǎo)各種炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生的機(jī)制，Hajishengallis[22]的研究表明：體內(nèi)免疫系統(tǒng)的Toll-like receptors（TLRs）和其他模式識(shí)別受體（pattern-recognition receptors，PRRs）組成了一種功能性受體復(fù)合物，識(shí)別并對(duì)病原菌相關(guān)模式分子（pathogen associated molecular patterns，PAMPs）起反應(yīng)。在這種相互作用中，菌毛作為一種病原菌相關(guān)模式分子與宿主細(xì)胞的模式識(shí)別受體復(fù)合物相結(jié)合。CD14和CD11b/CD18是一種募集性受體，TLRs則是一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體。TLR2和TLR4與介導(dǎo)菌毛活化細(xì)胞有關(guān)，其他的模式識(shí)別受體如CD14和CD11b/CD18與介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)菌毛的識(shí)別有關(guān)。菌毛通過激活TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，誘導(dǎo)單核細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和化學(xué)趨化因子IL-8，并誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞中協(xié)同刺激性分子CD40、CD80和CD86表達(dá)的上調(diào)。此研究結(jié)果也提示菌毛對(duì)宿主免疫系統(tǒng)有潛在的“危害”。

3）Pg菌毛誘導(dǎo)多種與調(diào)節(jié)骨代謝有關(guān)的細(xì)胞因子的產(chǎn)生，改變牙槽骨的代謝，誘導(dǎo)骨的吸收

Pg菌毛所誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞因子如IL-1、TNF-α是骨重建中重要的局部調(diào)節(jié)因子，在牙槽骨的吸收破壞中起重要作用，可促進(jìn)結(jié)締組織基質(zhì)的降解，刺激骨的吸收，與牙周炎密切相關(guān)[1]；IL-1、IL-8、TNF-α等細(xì)胞因子還可通過自分泌和旁分泌途徑，刺激更多的IL-1、IL-8、TNF-α的產(chǎn)生，使炎癥加重和擴(kuò)大，引起組織的進(jìn)一步破壞。提純的菌毛蛋白還能濃度依賴性的誘導(dǎo)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子HGF/SF的產(chǎn)生。HGF/SF，也名為趨化因子SF，由間充質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，主要作用于上皮細(xì)胞，與刺激破骨細(xì)胞的活化有關(guān)。

Evans[23]研究發(fā)現(xiàn)表達(dá)菌毛的Pg能誘導(dǎo)無菌鼠牙槽骨喪失，而不產(chǎn)生菌毛的Pg誘導(dǎo)無菌鼠牙槽骨喪失的能力顯著降低，而且用提純的菌毛蛋白免疫無菌鼠可預(yù)防Pg所導(dǎo)致的牙周組織的破壞。這也證實(shí)了菌毛與牙槽骨的吸收密切相關(guān)。

4）Pg菌毛抑制單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的凋亡

單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的凋亡可能與慢性炎癥性疾病密切相關(guān)。在缺乏生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)液中，Pg菌毛蛋白可抑制人單核細(xì)胞THP-1的凋亡。這種抑制作用能被抗菌毛蛋白的抗體所完全抑制。菌毛可激活細(xì)胞外信號(hào)傳導(dǎo)激酶（signal-regulated kinase，ERK），刺激細(xì)胞內(nèi)依賴細(xì)胞周期的蛋白激酶抑制劑p21的表達(dá)，從而阻斷單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的凋亡，提示菌毛可阻斷單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的凋亡，是慢性炎癥性疾病牙周病的一種重要的調(diào)節(jié)分子。

5）Pg菌毛誘導(dǎo)免疫反應(yīng)

慢性牙周炎與牙齦卟啉單胞菌感染不成熟樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）、誘導(dǎo)真皮下DCs和基底膜中成熟的DCs數(shù)量的增加有關(guān)。Jotwani[24]的研究證實(shí)fimA基因正常表達(dá)的菌株P(guān)g381與fimA基因的突變菌株P(guān)gDPG3相比，能更高效進(jìn)入單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞（monocyte-derived dendritic cells，MDDCs）中，誘導(dǎo)DCs的成熟。Pg381感染MDDCs后，能誘導(dǎo)高水平的自體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，誘導(dǎo)Th1-型免疫反應(yīng)。用菌毛蛋白刺激MDDCs，也能誘導(dǎo)DCs成熟，而且成熟的MDDCs還能誘導(dǎo)自體同源性CD4+T細(xì)胞的增殖，γ-干擾素（gamma interferon，IFN-γ）的釋放。這些結(jié)果提示Pg菌毛可能在誘導(dǎo)MDDCs吞噬Pg和誘導(dǎo)Th1-型免疫反應(yīng)中起重要作用。

Amano[25]報(bào)導(dǎo)在牙周炎病人體內(nèi)能檢測(cè)到高滴度的抗菌毛的特異性IgG和IgA抗體。Condorelli[26]報(bào)導(dǎo)在牙周炎病人71.7%活動(dòng)性位點(diǎn)和58.7%非活動(dòng)性位點(diǎn)的齦溝液（gingival crevicular fluid ，GCF）中能檢測(cè)到抗Pg菌毛的特異性IgA抗體，而在健康對(duì)照組的所有位點(diǎn)的GCF中均不能檢測(cè)到抗菌毛的特異性IgA抗體。這些流行病學(xué)研究的結(jié)果表明Pg菌毛具有良好的免疫原性，能在體內(nèi)誘發(fā)免疫反應(yīng)。

Pg菌毛所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)具有保護(hù)作用：Evans[23]等用提純的菌毛蛋白和一種人工合成的20個(gè)氨基酸的菌毛多肽免疫無菌鼠后，鼠血清中抗菌毛的特異性抗體滴度較用全菌免疫后鼠血清中的抗體滴度高3～4倍。當(dāng)給無菌鼠口腔接種Pg后，菌毛免疫鼠的牙周組織未受到破壞。Yanagita[27]以菌毛蛋白鼻腔黏膜免疫小鼠（霍亂毒素CT為免疫佐劑），能在黏膜效應(yīng)組織（包括鼻腔通道，頜下腺）的CD4+T細(xì)胞誘導(dǎo)Th1-/Th2-型免疫反應(yīng)。而且頜下腺產(chǎn)生的抗原特異性的IgA多克隆抗體可抑制Pg黏附于上皮細(xì)胞，減少上皮細(xì)胞細(xì)胞因子的產(chǎn)生。提示菌毛是一種有潛力的研制牙周炎疫苗的候選免疫原。

6）Pg菌毛誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞的形成

有學(xué)者報(bào)導(dǎo)Pg的感染與動(dòng)脈粥樣硬化[28]的發(fā)生有關(guān)。動(dòng)脈粥樣硬化是一種由血管壁開始的慢性炎癥性反應(yīng)，其中泡沫細(xì)胞的形成是其重要特點(diǎn)。Giacona[28]研究證實(shí)人體巨噬細(xì)胞在感染野生型Pg后，形成泡沫細(xì)胞的量明顯增加，但是感染fimA基因的突變菌株P(guān)g DPG3后沒有明顯的變化，提示菌毛是Pg誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞形成的必須因素，Pg菌毛可能與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生有關(guān)。

2.2 有關(guān)fimA基因表達(dá)調(diào)控的研究進(jìn)展

Pg fimA基因的表達(dá)途徑有以下三種[29]（按照表達(dá)和裝配系統(tǒng)分類）：陪伴/引導(dǎo)分子途徑系統(tǒng)、第二分泌系統(tǒng)、核化依賴聚合系統(tǒng)。fimA基因表達(dá)的初始產(chǎn)物具有非常長(zhǎng)的前序列。Pg蛋白酶參與fimA基因的翻譯后處理、轉(zhuǎn)運(yùn)和裝配[29]。fimA基因的表達(dá)還受到以下因素的影響。

1）局部理化環(huán)境對(duì)Pg fimA基因表達(dá)的影響

研究表明[30]，Pg fimA基因的表達(dá)及菌毛依賴性表型的活性均受到溫度、離子濃度等環(huán)境條件的影響。

齦下區(qū)的溫度并不恒定，常隨牙齒部位及炎癥程度而變[31]，健康齦下區(qū)溫度一般在34℃～37℃，而炎性牙周袋內(nèi)溫度　可達(dá)39℃。Xie等[32]通過fimA啟動(dòng)子-lacZ受體基因融合研究環(huán)境因素對(duì)Pg fimA基因表達(dá)的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)齦下區(qū)溫度由34℃升至39℃時(shí)，Pg fimA基因表達(dá)可減少至1/10。Murakami等[33， 34]的研究同樣證實(shí)溫度升高時(shí)，基因fimA的表達(dá)水平降低。Amano等[35]報(bào)導(dǎo)溫度從37℃提高到39℃時(shí)，Pg對(duì)唾液成分和鏈球菌的黏附能力降低，Pg在牙周炎病人的血清中的抗原性發(fā)生改變。溫度影響DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)，改變組蛋白與DNA結(jié)合的活性[36]，從而降低基因轉(zhuǎn)錄的速度[37]。Pg根據(jù)溫度的變化來調(diào)整fimA基因表達(dá)的水平，可能是在機(jī)體感染Pg早期，fimA基因表達(dá)水平較高，有利于Pg黏附及侵入牙周組織；隨著炎癥程度加重、牙周袋形成和局部溫度升高，菌毛的產(chǎn)生受到遏制，從而使菌毛的某些功能特性發(fā)生改變，而有利于Pg的生存。

基因fimA的表達(dá)還在轉(zhuǎn)錄水平受氯化高鐵血紅素濃度的調(diào)節(jié)[38]。鐵在Pg的生長(zhǎng)繁殖和毒力中起關(guān)鍵作用，Pg以血紅素的形式吸收鐵[39]。McKee[40]等發(fā)現(xiàn)，Pg在氯化高鐵血紅素過量時(shí)，毒力增強(qiáng)。在氯化高鐵血紅素不足時(shí)，Pg生長(zhǎng)速度降低，Pg菌體表面菌毛數(shù)量減少[40]，血凝素基因hagB和hagC的mRNA表達(dá)水平降低[41]，但是，致病因子如溶血素和胰蛋白酶樣蛋白酶等的數(shù)量及其致病毒力均明顯增加[42， 43]。為進(jìn)一步闡明氯化高鐵血紅素在調(diào)節(jié)fimA基因表達(dá)中的作用，Xie等[38]研究了fimA基因的轉(zhuǎn)錄活性，結(jié)果顯示在缺乏氯化高鐵血紅素的情況下，fimA啟動(dòng)子活性降低50%，表明氯化高鐵血紅素可以對(duì)Pg fimA基因表達(dá)起正調(diào)控作用。但是這種調(diào)控作用不如溫度變化對(duì)其影響的程度明顯。雖然在氯化高鐵血紅素缺乏時(shí)，Pg的生長(zhǎng)速度降低，但此時(shí)fimA啟動(dòng)子活性降低與Pg生長(zhǎng)速度的降低并沒有直接的聯(lián)系[38]，fimA啟動(dòng)子的活性并不依賴于Pg的生長(zhǎng)階段。氯化高鐵血紅素調(diào)節(jié)Pg fimA基因表達(dá)的具體分子機(jī)制仍不清楚，許多受離子調(diào)控的基因在其啟動(dòng)子區(qū)均存在“離子盒”，而在fimA啟動(dòng)子區(qū)并沒有與此具有同源性的區(qū)域結(jié)構(gòu)[44]。推測(cè)可能是由于Pg多種致病因子基因的表達(dá)共同受到氯化高鐵血紅素的調(diào)節(jié)所致。

影響Pg fimA基因表達(dá)的局部理化環(huán)境還包括血清、唾液、滲透壓、Ca2+濃度以及pH值等。

關(guān)于Pg如何感受到環(huán)境的變化，并把這種信息傳遞給細(xì)胞的機(jī)理并不完全清楚。但是研究發(fā)現(xiàn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的兩種成分FimS-FimR與Pg fimA基因的表達(dá)有關(guān)[45]。FimS是一種組氨酸蛋白激酶基因的等位基因，F(xiàn)imR是反應(yīng)調(diào)節(jié)基因的等位基因[45]。FimS 和FimR的分裂會(huì)導(dǎo)致菌毛形成量的明顯降低。fimA基因的表達(dá)可能受到FimR反應(yīng)調(diào)節(jié)器的正調(diào)控[46]。FimR調(diào)控包括fimA基因位點(diǎn)周圍的5個(gè)成串的基因——fimA cluster在內(nèi)的多個(gè)基因的表達(dá)。染色體免疫沉淀反應(yīng)和電泳分析表明，菌毛蛋白黏附到fimA cluster中的第一個(gè)基因的啟動(dòng)子區(qū)域。突變菌株的基因表達(dá)分析表明，fimA基因轉(zhuǎn)錄過程包括多個(gè)步驟，F(xiàn)imR基因上調(diào)fimA cluster中的第一個(gè)基因的表達(dá)，而此基因編碼一個(gè)在fimA基因的表達(dá)中起關(guān)鍵作用的調(diào)控蛋白。

2）其他口腔微生物對(duì)Pg fimA基因表達(dá)的調(diào)控

牙菌斑是一種附著了各種細(xì)菌的生物膜，這些菌斑微生物之間可以通過細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制互相影響。Pg通過與獲得性薄膜中的唾液分子[25]或者先前定殖的細(xì)菌如口腔鏈球菌[1]相接觸而定殖于牙菌斑生物膜中，然后與牙菌斑生物膜中的其他微生物共生。但是，Pg不能聚集于鏈球菌突變株或者S.cristatus這一底層的上面[47]。針對(duì)這一現(xiàn)象的進(jìn)一步研究揭示鏈球菌S.cristatus CC5A能明顯降低Pg的fimA基因的表達(dá)水平，其濃度與fimA基因表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，濃度升高時(shí)甚至可使fimA啟動(dòng)子活性下降1/2[48]。但是，在實(shí)驗(yàn)中尚未發(fā)現(xiàn)菌斑中的其他細(xì)菌，如纖細(xì)鏈球菌G9B和M5、血鏈球菌10556、變形鏈球菌KPSK2、內(nèi)氏放線菌NC-3、齒垢密螺旋體GM-1以及具核梭桿菌10953等對(duì)fimA基因的表達(dá)具有這種調(diào)控作用[49]。

目前的研究結(jié)果認(rèn)為，S.cristatus CC5A與Pg之間的這種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)開始于Pg受體對(duì)CC5A信號(hào)的識(shí)別[47]。信號(hào)分子是鏈球菌S.cristatus細(xì)胞膜表面的一種分子量為59kDa的CC5A蛋白，與其他革蘭氏陽(yáng)性菌分泌的短信號(hào)肽有明顯區(qū)別[49]。菌毛自身并非受體，fimA基因突變的Pg株與CC5A蛋白的結(jié)合與野生型Pg菌株與CC5A蛋白的結(jié)合沒有區(qū)別。這些結(jié)果表明，早期共生菌斑和后期致病性菌斑中的許多細(xì)菌并不影響fimA啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的活性，不影響Pg菌毛的產(chǎn)生，因而能夠與Pg相互共存。但是，S.cristatus CC5A能特異性地使Pg fimA表達(dá)水平降低，從而影響菌毛的產(chǎn)生，阻止Pg在菌斑內(nèi)的進(jìn)一步的繁殖。

3）Pg自身產(chǎn)物對(duì)fimA基因表達(dá)的調(diào)控

目前，定點(diǎn)誘變?cè)囼?yàn)表明[50]，在fimA基因上游區(qū)域存在一個(gè)σ70-識(shí)別的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)，研究證明，調(diào)節(jié)蛋白能夠與此位點(diǎn)特異性的結(jié)合，從而影響RNA聚合酶的功能。Xie等[48]發(fā)現(xiàn)有三種蛋白可結(jié)合于fimA基因，分別是菌毛蛋白、賴氨酸蛋白酶（Kgp）以及精氨酸蛋白酶（Rgp）的翻譯后處理片段。

將外源fimA啟動(dòng)子-LacZ受體插入攜帶fimA突變基因的Pg菌株內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)插入的外源性fimA啟動(dòng)子不能活化，fimA mRNA表達(dá)水平低；但若僅使fimA結(jié)構(gòu)基因上游區(qū)域產(chǎn)生突變，則不影響啟動(dòng)子的活性，fimA mRNA的表達(dá)水平與野生型菌株相同[48]。提示fimA基因在表達(dá)過程中，表達(dá)產(chǎn)物可作為調(diào)節(jié)蛋白與自身啟動(dòng)子上游區(qū)的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，從而正反饋性調(diào)節(jié)Pg fimA基因的表達(dá)。

Pg的半胱氨酸蛋白酶（Rgp和Kgp）也參與調(diào)節(jié)fimA基因的表達(dá)。有研究[51]報(bào)道當(dāng)rgp表達(dá)水平較低時(shí)，Pg表面菌毛數(shù)量減少。rgpA和kgp基因失活的Pg菌株YPP1和YPP2與野生型Pg相比，fimA mRNA表達(dá)水平明顯降低[52]。Pg 381的rgp A基因突變的變異株不表達(dá)菌毛，rgpB基因變異菌株表達(dá)的菌毛水平較野生型菌株低[48]。Tokuda[53]等也證明rgpA單基因突變菌株的fimA mRNA表達(dá)水平下降，表達(dá)的菌毛蛋白很少，通過Western印跡分析不能檢出菌毛蛋白，其表面的菌毛通過電鏡也無法觀測(cè)到。菌株P(guān)g 33277 的rgpA和rgpB雙基因缺陷變異菌株則不表達(dá)菌毛[48]。這些研究結(jié)果均證明蛋白酶可在轉(zhuǎn)錄水平直接影響菌毛蛋白的產(chǎn)生。此外，在菌毛蛋白翻譯后修飾加工的過程中，Pg蛋白酶還參與到對(duì)菌毛蛋白N-末端氨基酸的修飾加工。

這些資料均表明包括菌毛蛋白、Rgp和Kgp蛋白酶在內(nèi)的幾種Pg來源的蛋白都是fimA基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)的組成部分，它們能夠與fimA基因的上游區(qū)域結(jié)合，從而影響fimA基因的mRNA表達(dá)水平。

綜上所述，影響Pg fimA基因表達(dá)的因素有：局部理化環(huán)境，包括溫度、氯化高鐵血紅素的濃度、血清、唾液、滲透壓、Ca2+濃度以及pH值等；牙菌斑中的細(xì)菌如S.cristatus CC5A；Pg自身產(chǎn)物，如菌毛蛋白、Rgp和Kgp蛋白酶等。如能對(duì)fimA基因的表達(dá)過程詳細(xì)研究，在fimA基因轉(zhuǎn)錄的過程中加以某種干預(yù)，使Pg菌毛蛋白的轉(zhuǎn)錄、翻譯水平降低，或者使fimA基因翻譯后的修飾加工過程受到干擾，使菌毛所介導(dǎo)的Pg的黏附、侵入降低，病理性作用減少，就有可能降低Pg相關(guān)性牙周炎的發(fā)病率和嚴(yán)重性，這也是未來的一個(gè)研究方向。

2.3 有關(guān)fimA基因分子克隆的研究進(jìn)展

Dickinson等[54]1988年首次克隆并測(cè)序了Pg381 fimA基因。Fujiwara等[55]1993年克隆并測(cè)序了9種Pg菌株的fimA基因，結(jié)果揭示這9種Pg菌株的fimA基因覆蓋1044～1083 bp，所編碼的多肽分子量為37，527～38，239，菌株之間有一部分相同的序列，同時(shí)具有大量的不同序列。Fujiwara[55]首次按照fimA基因核苷酸序列的不同，將Pg分為4種基因型。

Sharma等[56]1993年首次用表達(dá)載體pET-lld，大腸桿菌BL21表達(dá)了Pg 2561的部分菌毛多肽（氨基酸10～337）。Washington等[57]1993年用表達(dá)載體pET-lld，大腸桿菌BL21表達(dá)了Pg 381 fimA的一部分片段（1 kb）（fimA基因全長(zhǎng)為1044bp）。

Sharma等[58]1996年首次構(gòu)建了表達(dá)部分菌毛多肽的重組鏈球菌——一種活載體疫苗。以pUC13Bg12.1為模板，將編碼Pg 2561 FimA蛋白部分肽段（N-末端55～145[90個(gè)aa]和C-末端233～322殘基[89個(gè)aa]）的基因，PCR擴(kuò)增后，定向插入到鏈球菌（Streptococcus gordonii）M6基因（emm6.1）的Kpn I-Hind III位點(diǎn)，獲得融合表達(dá)質(zhì)粒pSMB55，然后轉(zhuǎn)染于口腔鏈球菌（S. gordonii GP251）中，制備為一種以細(xì)菌為載體的基因工程減毒活疫苗。在鏈球菌M6蛋白（氨基酸1～122和302～441）的錨定區(qū)，表達(dá)菌毛多肽（氨基酸55～145和233～322），形成一種融合蛋白。此鏈球菌所表達(dá)的菌毛多肽可競(jìng)爭(zhēng)性的抑制Pg結(jié)合于唾液覆蓋的羥基磷灰石上。而且將此疫苗菌株口腔內(nèi)免疫無菌鼠后，可誘導(dǎo)血清異性IgA、IgG抗體和唾液異性IgA抗體的產(chǎn)生，并能防止Pg所導(dǎo)致的牙槽骨的吸收[59]。Sharma等[60]1999年進(jìn)一步在鏈球菌Streptococcus gordonii表面，表達(dá)FimA蛋白的C-末端多肽（226～246），但是實(shí)驗(yàn)證實(shí)這種包含游離半胱氨酸殘基的多肽在鏈球菌的表面表達(dá)很弱。

Kawabata等[61]1999年以克隆質(zhì)粒pSM36為模板克隆了fimA基因，以真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3首次構(gòu)建了fimA核酸疫苗pcDNA3/fimA。體外轉(zhuǎn)染NIH3T3真核細(xì)胞后，可檢測(cè)到菌毛蛋白的表達(dá)，說明了在真核細(xì)胞中表達(dá)FimA蛋白的可行性。定向唾液腺（TSG）免疫BALB/c小鼠后，成功的誘導(dǎo)了體液免疫和細(xì)胞免疫，在唾液和血清中能檢測(cè)到特異性抗體。免疫后的小鼠，血清中抗FimA特異性IgG抗體主要的亞類是IgG2a，唾液腺單核細(xì)胞Th2-型細(xì)胞因子特異性mRNA增加，脾中產(chǎn)生抗原特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。

Shin等[62]2005年首次報(bào)道在植物中表達(dá)菌毛多肽。Shin等[62]克隆FimA蛋白的C-末端氨基酸殘基266～337的編碼基因，然后插入到植物的表達(dá)載體中編碼CTB（霍亂毒素B亞單位）的基因片段的下游，然后此嵌合性載體ctb-fimA被轉(zhuǎn)染到馬鈴薯（Solanum tuberosum）細(xì)胞中表達(dá)蛋白。通過ELISA對(duì)CTB-FimA融合蛋白的定量分析表明，此蛋白占全部可溶性蛋白的0.33%，表達(dá)量較低，尚需要進(jìn)一步改進(jìn)。

國(guó)內(nèi)劉魯川[63]1994年首先以pUC13Bg12.1質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增fimA基因部分片段（504～1045 bp，總擴(kuò)增長(zhǎng)度為542 bp）。

郭紅梅[64]2007年成功的構(gòu)建了FimA蛋白與IL-15真核共表達(dá)質(zhì)粒，以其作為DNA疫苗經(jīng)滴鼻免疫Wistar大鼠，能夠激發(fā)　機(jī)體產(chǎn)生特異性的系統(tǒng)免疫應(yīng)答，又能激發(fā)粘膜免疫應(yīng)答。疫苗所表達(dá)的IL-15可以作為輔助因子增強(qiáng)sIgA應(yīng)答，對(duì)Pg引起的實(shí)驗(yàn)性牙周炎提供有效的保護(hù)，為解決增強(qiáng)sIgA應(yīng)答來對(duì)牙周組織提供保護(hù)的難題提供思路。

2.4 有關(guān)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)

2.4.1 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是目前最常用的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)[65] 。大腸桿菌系統(tǒng)由于其遺傳學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)方面已充分被人們了解，而且有大量可供選擇的克隆載體與表達(dá)載體，已經(jīng)成為表達(dá)許多異源蛋白質(zhì)的首選表達(dá)系統(tǒng)[66，71]。大腸桿菌遺傳圖譜明確，容易培養(yǎng)且費(fèi)用低，對(duì)許多蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的耐受能力，能高水平的表達(dá)這些蛋白質(zhì)。但是，在實(shí)際工作中，常常需要使外源基因得到最佳的表達(dá)，以滿足人們各種研究需要。此外，許多外源基因在大腸桿菌胞內(nèi)表達(dá)時(shí)，往往不能自發(fā)折疊卷曲生成有一定空間結(jié)構(gòu)的特定功能的蛋白質(zhì)，而是以一種不溶性的沉淀即包涵體的形式存在于細(xì)胞內(nèi)[67 ，68 ] 。包涵體的形成在某種程度上限制了大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用。由于處于包涵體中的重組蛋白沒有生物活性，為使重組蛋白具有生物活性，必須將包涵體復(fù)性，而包涵體的變性、復(fù)性一直困擾著許多科學(xué)工作者[69，70] 。

2.4.2 在大腸桿菌中表達(dá)外源蛋白的優(yōu)化[71]

1）翻譯效率的優(yōu)化：?jiǎn)?dòng)

有效啟動(dòng)翻譯需要起始密碼上游的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。翻譯起始過程中，5～9個(gè)核苷酸長(zhǎng)的Shine-Dalgarno序列與16S RNA的3'末端發(fā)生作用。Shine-Dalgarno序列與起始密碼ATG之間的距離對(duì)翻譯效率有影響，在ATG下游插入開放閱讀框架的載體，此段距離已經(jīng)優(yōu)化，如果克隆基因以自身的ATG起始翻譯，起始密碼應(yīng)位于Shine-Dalgarno序列下游5～7個(gè)核苷酸。

翻譯起始區(qū)的二級(jí)結(jié)構(gòu)也影響基因表達(dá)效率。Chen等通過改變Shine-Dalgarno序列上、下游的核苷酸，減少二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成，提高了基因表達(dá)水平。與此類似，也有一些基因通過共翻譯，也就是在一段翻譯序列的下游插入目的基因編碼序列，提高了表達(dá)水平。

2）密碼子的使用

遺傳密碼與氨基酸并不是一對(duì)一的關(guān)系，61種密碼子編碼20種氨基酸，而其中只有兩種是由單一密碼子編碼的，其余的18種中的每一種都有多個(gè)密碼子，編碼同一種氨基酸的不同密碼子的使用頻率也是不同的。

如果編碼區(qū)中有大量的或成串兒的稀有密碼子，通過突變或基因重合成去除這些稀有密碼子，可以提高表達(dá)水平。另外，如果靶序列中有稀有密碼子AGA或AGG，會(huì)帶來一些特殊問題，因?yàn)樗鼈冊(cè)诰幋a區(qū)內(nèi)部又形成額外的Shine-Dalgarno序列。

編碼外源蛋白氨基酸的序列對(duì)表達(dá)水平也有很大影響。因此有必要用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）或定點(diǎn)突變的方法，把表達(dá)基因N端的7～8個(gè)密碼子變成大腸桿菌中最常用的密碼子。還應(yīng)盡可能通過這些方法將靶基因5'端（G+C）含量降至40％以下。

3）培養(yǎng)條件優(yōu)化

在表達(dá)系統(tǒng)相同的情況下，不同的培養(yǎng)基常導(dǎo)致表達(dá)水平的巨大差異。LB類標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基可以用于建立表達(dá)的基本參數(shù)，但只有對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化后，才能獲得最佳表達(dá)，包括使用基本鹽培養(yǎng)基，如M9，限定鹽培養(yǎng)基，如誘導(dǎo)培養(yǎng)基，或豐富培養(yǎng)基，如肉湯、YT或NZCYM。

一些培養(yǎng)基添加劑能提高某一種特定蛋白的表達(dá)水平。這其中包括濃度在0.1～0.5 mol/L之間的NaCl、不可代謝糖如蔗糖（0.2～0.6 mol/L）、輔助因子（血紅素）和抗生素。Lee和Beckwith注意到，分泌途徑缺陷的抑制基因位于與蛋白質(zhì)合成有關(guān)的基因上，這些抑制突變的最終效果是降低蛋白合成速率，而低濃度抗生素能在大腸桿菌中模擬它的作用。表達(dá)外源蛋白尤其是分泌蛋白時(shí)，在培養(yǎng)基中加入抗生素，如氯霉素（1 μg/ml）和四環(huán)素（0.1 μg/ml），能降低蛋白合成速率，防止分泌系統(tǒng)過載，分泌蛋白也就更容易與伴侶分子等結(jié)合，折疊成天然構(gòu)象。最后，培養(yǎng)基的pH也能影響外源蛋白的表達(dá)，當(dāng)LB培養(yǎng)基的pH降至5.5以下時(shí)，可溶性的α-葡萄糖苷酶的表達(dá)量顯著提高。極端pH可能會(huì)使細(xì)胞生長(zhǎng)速率降低，從而防止細(xì)菌表達(dá)/加工系統(tǒng)過載。

在克隆基因的上游插入強(qiáng)的可調(diào)節(jié)啟動(dòng)子和有效的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，可以在細(xì)菌中表達(dá)非融合蛋白。融合蛋白能大量制備，易于純化，而且能賦予蛋白新的免疫學(xué)或生物學(xué)分析反應(yīng)特性。

2.5 六聚組氨酸融合蛋白的純化

近年來，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究的發(fā)展，基因工程重組蛋白的分離純化技術(shù)顯得尤為重要，要將目標(biāo)蛋白從復(fù)雜樣品中快速、特異地純化出來，就需要選擇合適的蛋白純化方法。

融合標(biāo)簽技術(shù)是20世紀(jì)末興起的一種基于報(bào)告基因的重組DNA技術(shù)。融合標(biāo)簽技術(shù)的發(fā)展使重組蛋白質(zhì)的純化更加快速、簡(jiǎn)便，并很快得到了應(yīng)用。目前常用的蛋白純化標(biāo)簽是GST（谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶），6×His（六聚組氨酸）和表位標(biāo)簽（如FLAG是專為蛋白純化和檢測(cè)設(shè)計(jì)的八肽，HA是流感病毒血凝素表位等），其中6×His最為常用，帶有6×His標(biāo)簽的融合蛋白可利用固定化金屬鰲合親和層析和免疫親和法進(jìn)行純化。

Porath于1975年首次提出固定化金屬螯合親和層析(IMAC)的概念[72]，該法基于蛋白質(zhì)表面的組氨酸、半胱氨酸、色氨酸等殘基與固定化金屬離子的相互作用而對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化。其中，組氨酸是與金屬離子作用較強(qiáng)的氨基酸，含有多個(gè)組氨酸的蛋白質(zhì)可在IMAC中有效保留，故人為設(shè)計(jì)的多聚組氨酸便成為最常用的蛋白質(zhì)純化標(biāo)簽[73]。

免疫親和純化是一種利用抗原抗體特異性可逆結(jié)合特性的技術(shù)，它具有高效、高收率、濃縮效應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。在眾多蛋白質(zhì)純化技術(shù)中，免疫親和純化是十分關(guān)鍵的技術(shù)。標(biāo)簽融合蛋白可通過抗標(biāo)簽的單克隆抗體和多克隆抗體來純化。多數(shù)免疫親和純化都使用單克隆抗體，但有兩種類型的多克隆抗體可用于免疫親和純化，即針對(duì)合成肽(如6×His、FLAG標(biāo)簽等)或某種抗原的特定區(qū)域產(chǎn)生的抗體。在這兩種情況下，由于結(jié)合到固定化抗體上的抗原位點(diǎn)局限在一個(gè)很小的區(qū)域，因此可實(shí)現(xiàn)有效的洗脫。目前已有商品化的特異性針對(duì)標(biāo)簽的單克隆抗體，但價(jià)格都比較昂貴。

重組蛋白在大腸桿菌（E. coli）高效表達(dá)時(shí)，往往以不溶的、無活性的蛋白聚集體，即包涵體(inclusion body)的形式存在于細(xì)胞內(nèi)。必須從細(xì)胞內(nèi)分離出包涵體，采用高濃度變性劑（如7.0 mol/L鹽酸胍、8.0 mol/L脲）溶解包涵體，然后除去變性劑或降低變性劑的濃度，使包涵體蛋白得以復(fù)性，最后再用色譜法使目標(biāo)蛋白質(zhì)得到純化。其中包涵體蛋白的復(fù)性和純化是整個(gè)過程中的核心。

2.5.1 融合標(biāo)簽技術(shù)

1）融合標(biāo)簽技術(shù)

融合標(biāo)簽技術(shù)是20世紀(jì)末興起的一種基于報(bào)告基因的重組DNA技術(shù)，其主要過程是利用重組DNA技術(shù)在靶蛋白編碼基因的3'端或5'端融合某種標(biāo)簽的編碼基因，通過適宜的宿主來表達(dá)重組蛋白質(zhì)[74-78]，表達(dá)的重組蛋白質(zhì)可以通過融合的標(biāo)簽與包被在固相基質(zhì)上的特異配基結(jié)合而進(jìn)行純化。融合標(biāo)簽技術(shù)的發(fā)展使重組蛋白質(zhì)的純化更加快速、簡(jiǎn)便。近幾年，隨著新的融合標(biāo)簽系統(tǒng)的開發(fā)，其功能逐漸多樣化，除用于蛋白質(zhì)純化外，還用于蛋白質(zhì)定位和檢測(cè)等。

2）融合標(biāo)簽的種類

融合標(biāo)簽根據(jù)其分子量大小可分為兩大類:大的蛋白質(zhì)分子(或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域及其衍生物)和小的多肽片段。大的蛋白質(zhì)標(biāo)簽有GST(谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶)、SPA(葡萄球菌蛋白A)和GFP(綠色熒光蛋白)等，它的使用會(huì)增加目標(biāo)蛋白的溶解性，但在蛋白結(jié)晶和抗體產(chǎn)生等過程中，標(biāo)簽必須去除。小的多肽標(biāo)簽有6×His(六聚組氨酸)、HA(流感病毒血凝素表位)、c-myc(人c-myc蛋白表位)、FLAG(專為蛋白純化和檢測(cè)設(shè)計(jì)的八肽)等，多數(shù)情況下，由于多肽標(biāo)簽相對(duì)較小，對(duì)融合蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)影響小，不需要從融合蛋白質(zhì)中切除，因而多肽標(biāo)簽較蛋白質(zhì)標(biāo)簽更為常用。迄今為止，己有文獻(xiàn)較為詳盡地報(bào)道了各種融合標(biāo)簽[79，80]，其大小從幾個(gè)氨基酸到蛋白質(zhì)不等，相互作用類型包括酶與底物、細(xì)菌受體與血清蛋白、六聚組氨酸與金屬離子、抗原與抗體等[81]。

3）融合標(biāo)簽技術(shù)用于蛋白的純化

融合標(biāo)簽技術(shù)用于重組蛋白質(zhì)純化已為大量實(shí)驗(yàn)所證實(shí)[82-86]。理論上，根據(jù)親和純化原理可定向設(shè)計(jì)使目標(biāo)蛋白質(zhì)與純化基質(zhì)之間不發(fā)生任何直接相互作用的融合標(biāo)簽，以避免由于這種直接相互作用造成蛋白質(zhì)變性。目前已有許多不同的標(biāo)簽可供利用。它們利用了標(biāo)簽與固相配體間的相互作用，從而可從復(fù)雜的提取物中對(duì)標(biāo)簽融合蛋白進(jìn)行選擇性的結(jié)合和洗脫。目前常用的蛋白純化標(biāo)簽是GST，His和表位標(biāo)簽。

最常用的標(biāo)簽是His標(biāo)簽，即多聚組氨酸。該標(biāo)簽由6～10個(gè)連續(xù)組氨酸組成，置于蛋白的氨基或羧基末端。His標(biāo)簽與其他標(biāo)簽相比有很多明顯優(yōu)勢(shì)：①對(duì)金屬離子如鎳、鈷有高度的選擇性和親和力[87]；②與金屬離子的結(jié)合不受變性劑(尿素、胍)的影響；③溫和多樣的洗脫條件(100～250 mmol/L咪唑，低pH，10 mmol/L EDTA)。目前已有各種商品化介質(zhì)(Ni-NTA-Agarose，Ni-IDA-Agarose)提供。另外，抗His標(biāo)簽的單抗或多抗也被應(yīng)用于His融合蛋白的純化。

GST標(biāo)簽是用來從細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中純化蛋白較為成功的標(biāo)簽之一。在該系統(tǒng)中，GST與被標(biāo)記的蛋白進(jìn)行融合，融合后的蛋白可在許多表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。GST和谷胱甘肽緊密結(jié)合，融合蛋白可通過谷胱甘肽固相柱純化，洗脫未結(jié)合的蛋白后，結(jié)合蛋白可用含游離的谷胱甘肽緩沖液進(jìn)行洗脫。該系統(tǒng)中被融合的目標(biāo)蛋白?？烧_的折疊成為有功能的區(qū)域，故十分有用。該系統(tǒng)的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是可快速、溫和地純化，且配體谷胱甘肽的成本較低。

表位標(biāo)簽(HA、c－myc和FLAG等)也已廣泛用于融合蛋白的純化研究。目前已有商品化針對(duì)表位標(biāo)簽的單克隆抗體。為使標(biāo)簽在純化中發(fā)揮良好的作用，在純化過程中應(yīng)盡量避免使用劇烈的條件使抗體和標(biāo)簽之間解離，劇烈的條件可使抗原發(fā)生不可逆變性，目標(biāo)蛋白的回收率低。用游離多肽競(jìng)爭(zhēng)洗脫法洗脫結(jié)合在固相抗體上的標(biāo)簽融合蛋白，是優(yōu)選的方法。

4）融合標(biāo)簽技術(shù)在其他領(lǐng)域的應(yīng)用

融合標(biāo)簽可提高重組蛋白的產(chǎn)量，由于外源蛋白質(zhì)對(duì)于宿主菌的異質(zhì)性，當(dāng)外源蛋白質(zhì)在宿主菌內(nèi)表達(dá)時(shí)，宿主菌會(huì)調(diào)動(dòng)各種機(jī)制來阻止外源蛋白質(zhì)過量表達(dá)，導(dǎo)致的直接后果就是我們所需要的目標(biāo)蛋白質(zhì)表達(dá)量降低。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)外源蛋白質(zhì)融合某些特定的標(biāo)簽后，能夠有效增加重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)量[88-90]。

融合標(biāo)簽還可增強(qiáng)重組蛋白質(zhì)的可溶性，外源蛋白質(zhì)在宿主菌內(nèi)表達(dá)時(shí)大多以包涵體形式存在[91]，致使很難獲得大量有活性的天然蛋白質(zhì)。為了防止包涵體形成，一般可以采用低溫誘導(dǎo)表達(dá)蛋白質(zhì)，但這種方法并非對(duì)所有蛋白質(zhì)都有效。研究發(fā)現(xiàn)，一些高度可溶的蛋白質(zhì)在與其他蛋白質(zhì)融合后會(huì)促進(jìn)融合蛋白質(zhì)以可溶形式表達(dá)，如MBP等[92，93]。

2.5.2 金屬螯合親和層析技術(shù)

1）金屬螯合親和層析技術(shù)的發(fā)展

1948年，Hearon發(fā)現(xiàn)水溶液中組氨酸和半胱氨酸可與Cu2+，Zn2+形成穩(wěn)定的復(fù)合物。研究還發(fā)現(xiàn)，固定在凝膠上的金屬離子Cu2+或Zn2+可與蛋白質(zhì)表面裸露有咪唑基或巰基的氨基酸殘基結(jié)合。因此，含有金屬離子Cu2+或Zn2+的凝膠可用來選擇性吸附表面含有組氨酸或半胱氨酸的多肽或蛋白質(zhì)。

1961年，Hellferich提出以固定于載體的金屬離子來分離小分子的概念，稱為配基交換層析(ligand exchange chromatography，LEC)[94，95]。

1975年，Poroth首次提出“固定化金屬螯合親和層析(Immobilized Metal-Chelated Affinity Chromatography，IMAC)”的概念[72]，首次成功地在瓊脂糖凝膠上偶聯(lián)了螯合配基亞氨基二乙酸(IDA)。IDA與金屬離子如Cu2+螯合后，可與蛋白質(zhì)結(jié)合，不同組成的蛋白質(zhì)與金屬離子結(jié)合力不同，據(jù)此將蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。最常用的金屬離子包括Cu2+，Ni2+，Zn2+和Co2+等過渡態(tài)金屬離子。不同蛋白質(zhì)分子內(nèi)的組氨酸、半胱氨酸以及色氨酸等殘基種類、數(shù)量、位置和空間構(gòu)象不同，因而與金屬配基的親和力大小不同，從而可選擇性地加以分離純化。

1987年，Hochuli等[96]在目標(biāo)蛋白質(zhì)末端接上六聚組氨酸多肽得到純化的重組蛋白質(zhì)。此后六個(gè)組氨酸標(biāo)簽廣泛應(yīng)用于重組蛋白質(zhì)的純化。近年來，原核生物表達(dá)的重組蛋白質(zhì)已有50%以上都是通過末端接有六聚組氨酸多肽而被純化出來[97]。

目前，固定化金屬螯合親和層析技術(shù)已成為蛋白質(zhì)，特別是基因重組蛋白和多肽分離純化最有效的工具之一。

2）金屬螯合親和層析作用原理

固定化金屬螯合親和層析基于蛋白質(zhì)表面氨基酸與固定化金屬離子的親和力不同對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。金屬螯合親和介質(zhì)與蛋白質(zhì)的作用如圖2.1所示。過渡態(tài)金屬離子能與電子供體氮、硫、氧等原子以配位鍵結(jié)合，金屬離子上剩余的空軌道是電子供體的配位點(diǎn)，在溶液中被水分子或陰離子占據(jù)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)表面氨基酸殘基與金屬離子的結(jié)合力較強(qiáng)時(shí)，氨基酸殘基的供電原子(如組氨酸殘基的N原子、半胱氨酸殘基的S原子)將取代與金屬離子結(jié)合的水分子或陰離子，與金屬離子形成復(fù)合物，從而使蛋白質(zhì)分子結(jié)合在固相介質(zhì)表面。氨基酸中的α-氨基和α-羧基，以及某些氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)含有孤對(duì)電子的活性原子都能參與螯合反應(yīng)，由于蛋白質(zhì)表面這些氨基酸的種類、數(shù)量、位置和空間構(gòu)象不同，因而與金屬配基的親和力大小不同，從而可選擇性地加以分離純化[98]。

圖2.1 金屬螯合親和介質(zhì)與蛋白質(zhì)的作用

生物分子與金屬離子間的結(jié)合強(qiáng)度與它們的軌道重疊程度有關(guān)，結(jié)合作用可分為三種[99-100]：

（1）靜電吸引：修飾后的基質(zhì)帶有凈負(fù)電荷，它可吸附分離表面氨基酸殘基帶正電荷的蛋白質(zhì)。

（2）配位鍵結(jié)合：蛋白質(zhì)表面的組氨酸、色氨酸、半胱氨酸等殘基上有咪唑基、吲哚基、巰基等，其氮原子、硫原子上未共用電子對(duì)與固定化金屬離子形成配位鍵。

（3）共價(jià)鍵結(jié)合：固定化金屬離子與蛋白質(zhì)表面含硫基團(tuán)作用形成共價(jià)鍵。

蛋白質(zhì)與金屬離子親和力不同可用Pearson的軟硬酸堿理論來解釋[101]。該理論認(rèn)為兩個(gè)原子相互作用成鍵時(shí)，其中一個(gè)原子作為路易斯酸，另一個(gè)作為路易斯堿。根據(jù)軟硬酸堿理論，金屬離子如K+、Ca2+、Mg2+、Fe3+屬于硬酸；單價(jià)金屬離子如Ag+、Cu+歸類為軟酸；過渡態(tài)金屬離子如Cu2+、Co2+、Ni2+、Zn2+屬于中間酸。相應(yīng)的，與金屬離子結(jié)合的配基如氨基酸或蛋白質(zhì)可分為三類堿，其中含氧原子(如羧基)、脂肪族的氮原子(如天冬氨酸和谷氨酸)和磷原子(如磷酸化的氨基酸)的配基屬于硬堿；含硫原子(如半胱氨酸)的配基屬于軟堿；含芳香族氮原子(如組氨酸、色氨酸)的配基屬于中間堿。中間酸Cu2+、Co2+、Ni2+、Zn2+可與含芳香族氮原子(如組氨酸、色氨酸)的中間堿以及半胱氨酸結(jié)合。由于蛋白質(zhì)表面裸露氨基酸中半胱氨酸極少，因此組氨酸殘基是與過渡態(tài)金屬離子結(jié)合的主要基團(tuán)[102]。

六聚組氨酸融合蛋白在金屬螯合親和層析介質(zhì)表面結(jié)合和解離流程如下：

（1）將螯合配基以共價(jià)結(jié)合的方式固定在固相載體上。

（2）加入含有金屬離子如Co2+、Ni2+的溶液，金屬離子會(huì)與螯合配基形成配位鍵而固定在固相載體上。

（3）加入含有六聚組氨酸融合蛋白的溶液或發(fā)酵液，使六聚組氨酸融合蛋白與金屬離子間以配位鍵方式結(jié)合在固相載體上，而與金屬離子沒有作用力的蛋白被分離出去。

（4）洗脫結(jié)合在固相載體上的六聚組氨酸融合蛋白。對(duì)金屬螯合親和層析介質(zhì)上所結(jié)合的六聚組氨酸融合蛋白常用pH值(pH 4～5)或含咪唑的溶液進(jìn)行洗脫，低pH可減弱蛋白和金屬離子的相互作用，使六聚組氨酸融合蛋白得以洗脫，而咪唑是競(jìng)爭(zhēng)性取代劑，可置換結(jié)合在介質(zhì)上的六聚組氨酸融合蛋白，較低的pH和咪唑互相配合可更好地使六聚組氨酸融合蛋白被洗脫[103]。

3）金屬離子的選擇

金屬離子的配位數(shù)直接影響其與螯合配基及生物分子的結(jié)合，配位數(shù)既要保證能與螯合配基形成穩(wěn)定的化合物，又要保證有剩余的位點(diǎn)與目標(biāo)蛋白的氨基酸殘基結(jié)合。由于金屬離子所帶電荷、離子半徑等不同，對(duì)蛋白質(zhì)呈現(xiàn)不同親和力，目前常用金屬離子有Cu2+、Co2+、Ni2+、Zn2+等，它們具有相同電荷，離子半徑分別為69、72、74和74pm。半徑越小，配位作用越強(qiáng)，與蛋白質(zhì)形成的絡(luò)合物越穩(wěn)定。因此，Cu2+對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)合力最強(qiáng)，Ni2+次之，Co2+和Zn2+結(jié)合相對(duì)較弱[104]。

4）金屬螯合親和層析用于生物分離純化

篇（4）

作為上海世博會(huì)贊助商,上海和黃白貓有限公司(以下簡(jiǎn)稱和黃白貓)將為世博會(huì)提供超過100種專業(yè)清潔產(chǎn)品和工具。在世博各場(chǎng)館、廁所、員工餐廳、社會(huì)餐廳、廚房,乃至世博局等公共區(qū)域都將使用和黃白貓的專業(yè)清潔用品和服務(wù)。

和黃白貓是由和記黃埔有限公司控股子公司與上海白貓(集團(tuán))有限公司于2006年3月共同組建的中外合資企業(yè)。公司前身可追溯到1948年成立的上海永新化學(xué)工業(yè)股份有限公司。該公司創(chuàng)立的“白貓”品牌,自1963年起已有近半個(gè)世紀(jì)的輝煌歷史,在中國(guó)深入千家萬戶。

白貓清潔世博

記者在采訪中了解到,和黃白貓?jiān)谑啦?huì)項(xiàng)目贊助商名單上脫穎而出,完全體現(xiàn)了優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)與互惠互利。

從2008年上半年和黃白貓就開始和世博局進(jìn)行贊助事宜接觸,應(yīng)該算是日化行業(yè)里比較早的一家。

上海世博會(huì)“城市,讓生活更美好”的主題與和黃白貓的品牌宗旨和核心價(jià)值――“干凈到家了”完全吻合,這也成為了合作雙方談判與合作的基礎(chǔ)。

和黃白貓董事長(zhǎng)杜志強(qiáng)在接受《小康•財(cái)智》記者采訪時(shí)說,“白貓”作為中國(guó)本土著名品牌、中華老字號(hào),在全國(guó)特別是華東及上?？芍^家喻戶曉?！案匾氖?和黃白貓擁有民用清潔產(chǎn)品和專業(yè)清潔產(chǎn)品兩個(gè)事業(yè)部,可以配套為世博會(huì)提供完整的產(chǎn)品與相關(guān)服務(wù)。這也是我們能服務(wù)世博會(huì)的最大優(yōu)勢(shì)?！?/p>

杜志強(qiáng)稱,世博會(huì)期間預(yù)計(jì)有超過7000萬人次的參觀者,這一數(shù)字是2005年日本愛知世博會(huì)的近3倍、2008年北京奧運(yùn)會(huì)的10倍。如此大的人流量對(duì)世博園區(qū)的公共衛(wèi)生安全工作是一個(gè)極大的挑戰(zhàn),其中,世博各場(chǎng)館、廁所、廚房等公共區(qū)域的清潔消毒衛(wèi)生工作尤為重要。

他介紹,為了配合世博會(huì)對(duì)于公共區(qū)域衛(wèi)生安全的要求,和黃白貓的專業(yè)用品事業(yè)部專門設(shè)計(jì)與開發(fā)了一系列清潔產(chǎn)品、清潔工具以及與之配套的培訓(xùn)、服務(wù)系統(tǒng)。

世博衍生價(jià)值無限

作為上海世博會(huì)贊助商,和黃白貓為上海世博會(huì)提供現(xiàn)金以及產(chǎn)品與服務(wù)的贊助。

杜志強(qiáng)稱,受贊助協(xié)議保密條款的限制,不便透露現(xiàn)金以及產(chǎn)品與服務(wù)的具體價(jià)值?！安贿^,我們更看重產(chǎn)品與服務(wù)這塊,因?yàn)樗鼘⒅苯臃?wù)于上海世博園區(qū)和參觀者。與現(xiàn)金贊助相比,它的衍生價(jià)值是無限的?！?/p>

篇（5）

我傷心地趴在地上，嚎啕大哭。周圍的人們卻用奇怪的眼神看著我，然后鄙視地說：“這么小就發(fā)春了……”我聽不懂意思，然后無奈地磨爪子，摸摸自己可愛的小絨毛和小肉墊，然后發(fā)誓今天晚上我很傷心，決心只吃一條魚。我聽見過其他野貓叫的聲音，還問過一只老貓，她喵嗚喵嗚地告訴我，野貓半夜貓叫一般都在發(fā)春，我眨眨眼睛問她什么是發(fā)春。她搖搖頭深沉地告訴我，小孩子懂這么多要干么。然后很善良地還教我發(fā)出喵嗚喵嗚拉長(zhǎng)的聲音，她說這個(gè)貓叫聲聽起來比較嫵媚，以后我擇偶的時(shí)候，提供給我選擇的公貓會(huì)比較多。我感激地讓她摸了摸我的粉紅小肉墊。

晚上我真的只吃了一條魚。從垃圾桶撿來的，味道很惡心?？墒悄侵焕县埜嬖V我，貓都喜歡魚的。我是貓，當(dāng)然喜歡魚，于是我咽了下去。我做了個(gè)夢(mèng)，夢(mèng)到有一只善良的母貓還有一只猥瑣的不明生物。不明生物對(duì)母貓不知說了什么，母貓?bào)@叫不要。她滿臉是淚，我見尤憐。我同情心泛濫，卻不知道怎么安慰母貓。

然后一覺醒來我發(fā)現(xiàn)我換了新地方。不是那個(gè)舒服的紙皮堆，而是干干凈凈的毛毯。我一滾，毛毯就變色了。變得黑黑的臟臟的，上面還有我的爪子印。我默哀著毛毯，一邊打量自己所在的地方。是屋子，有家具，有吃的。打量完畢。

另一間屋子的門突然開了，嘎吱的聲音讓我覺得很悅耳。然后我抬頭以45°明媚而憂傷的姿勢(shì)仰望。是一個(gè)人類。有頭發(fā)有眼睛，還有嘴巴鼻子和耳朵。然后是雄性。

雄性人類似乎驚訝于我的蘇醒，然后不管不顧地?fù)渖蟻砗魡疚倚咝摺艺痼@而憤怒，我做為一個(gè)雌性貓咪，絕對(duì)不能讓一個(gè)雄性人類破壞了我的和清白！我爪子抓過去，然后憤怒地要撕咬。結(jié)果雄性人類卻猥瑣地摸了摸我引以為傲的粉色小肉墊傻乎乎地笑了。

這件事情過去一年多了，我也不再是年幼無知的小野貓了。我成了這位雄性人類口中的寵物，名字叫做羞羞。據(jù)說我是他口中從天而降的莫名其妙的寶貝。他讓我喚他主人，我扭捏地給他一爪子。因?yàn)樗粌H是個(gè)猥瑣的變態(tài)，還好面子，勒令我不準(zhǔn)在他房間撒尿。

現(xiàn)在我是一只小家貓，我有名字，我叫羞羞。

二

老大！怎么辦?。⊙U裊跟著那個(gè)人類住在一起了！一只哭泣的水獺以明媚而憂傷45°仰望高高在上，實(shí)際比自己矮的一只狐貍。

，我們不會(huì)去搶回來??！王上只規(guī)定我們把裊裊帶回來，其他的什么都沒規(guī)定，怕什么。天塌下來，有例如我這樣高的狐貍頂著。

水獺的內(nèi)心淚水在洶涌。明明我一直比你高的……

二人組制訂了完美的計(jì)劃。名字很好很動(dòng)聽，叫做裊裊的浪子回歸路。

請(qǐng)?jiān)忂@兩只動(dòng)物的用詞不當(dāng)，畢竟這是這兩只動(dòng)物商量一晚上否決一晚上得出的理論。

第一步。裊裊出現(xiàn)了，好白好亮的皮毛??！狐貍羨慕地望向那只白色的貓，然后變身狐貍?cè)乃慌赃厒窝b成老鼠的樹獺揪著辦正事。老大老大，那個(gè)雄性人類要上班了，裊裊現(xiàn)在一個(gè)人在家，我們?nèi)尠桑?/p>

狐貍淡定了，高傲地對(duì)書獺說。你進(jìn)攻，我?guī)湍闼奶幙粗?。樹獺內(nèi)心更有淚水奔騰。不帶這么欺負(fù)樹獺的啊。樹獺不情不愿地顫抖著走到貓的面前。你好……嗨……

白貓無視了這只奇怪的老鼠，思索著今天好像沒有摸自己的小肉墊。

樹獺的膽子大了起來，然后慢慢捂住白貓的眼睛，大叫著。狐貍老大快來幫忙?。?/p>

白貓一爪推開這只找死的老鼠，繼續(xù)思索這個(gè)偉大的問題。

引誘裊裊的回歸路。宣告毀滅。

第二步。很好，裊裊又出現(xiàn)了。

樹獺舉著一條自己很舍不得的魚隆重做了告別儀式，狐貍又氣又急，然后在一旁安慰自己他笨他腦子有問題……樹獺舉著這條魚，從陽(yáng)臺(tái)上悄悄進(jìn)入白貓所在的屋子。安穩(wěn)入睡的白貓翻了個(gè)身，繼續(xù)睡。樹獺堅(jiān)持不懈地把魚高舉于白貓的眼前。

白貓翻了個(gè)身，還是睡。其實(shí)無論怎么翻，她仍然是趴著的。

內(nèi)心激浪的樹獺仰天淚流。狐貍老大，裊裊的浪子回歸路，任重道遠(yuǎn)啊……

第三步。決心自己出手的狐貍相信自己一定能使裊裊重新回到他們身邊的。他趁著裊裊在大街上閑逛的時(shí)候，攔住了她。然后飛撲著流淚……裊裊，我是狐貍叔叔啊……

白貓羞羞覺得自己今天遇到了兩只神經(jīng)病。狐貍哭訴著自己這幾年過得不好，王上虐待，沒有裊裊在身邊寂寞難耐……羞羞無語地望天。 狐貍終于說出了一句正常嚴(yán)肅的話。羞羞，跟我走，大家都找?煤鎂昧恕

茫然的羞羞抖了抖耳朵。狐貍嚴(yán)肅地對(duì)著茫然的白貓教育道。你是王上的三姑媽的六阿姨的四妹妹生的女兒，由于王上的三姑媽的六阿姨的四妹妹生你時(shí)跑出了生命森林，最后把你生在了人類世界，卻和你失散了……裊裊，你媽媽很想你。

白貓羞羞石化了。沒想到自己還有個(gè)媽媽？！而且自己根本不是人類世界的普通貓？！太驚悚了，比和雄性人類看所謂鬼片還驚悚！ 無法接受現(xiàn)實(shí)的白貓羞羞可恥地暈過去了……

三

白貓羞羞知道這次醒來一定在不同的地方。

是洞穴。

一只善良的白貓淚奔著朝自己飛撲而來。不用說，這是夢(mèng)中的善良白貓，也是狐貍口中的媽媽了。被媽媽緊抱著的羞羞感到一種從未有過的幸福。很滿足，比吃了雄性人類給自己的貓飼料還滿足。

洞穴外漸漸有個(gè)黑點(diǎn)朝著自己走來。羞羞抬起頭，卻看到一匹純白的似馬非馬的物種。善良白貓熱情地介紹物種。這是馬貓，是王上，至于輩分……怎么也想不出怎么讓裊裊稱呼馬貓的貓媽糾結(jié)著。

羞羞看著馬貓，眨巴著貓眼善良地問了一句。難道你真是馬和貓生出來的？羞澀的馬貓不好意思地承認(rèn)了。

被雷得風(fēng)中凌亂的羞羞仰天無語。

生命森林的動(dòng)物很奇特。生命森林的動(dòng)物很人類化。生命森林的動(dòng)物很好相處。

善良的貓媽，猥瑣的狐貍和樹獺，以及奇怪物種馬貓。從這一天起，羞羞正式改名為裊裊。

裊裊卻時(shí)常很憂傷，她想起雄性人類的家，想起那群人類世界的野貓，想起雄性人類的溫柔，想起他的忍讓。裊裊嘆了口氣。難道自己還不知足么？

善解人意的貓媽讓裊裊最后一次回去人類世界。裊裊回到了她和雄性人類住的屋子。很干凈，地上還殘留著她的貓毛?？墒沁@個(gè)時(shí)候，雄性人類不是下班了么？她看到桌上有一疊紙，寫著鳥語，不懂。卻看到有照片，照片上驕傲的白貓不屑地望著鏡頭。

裊裊的眼角有透明液體。她自我安慰：貓是不輕易流淚的。

雄性人類回到了家，他看到裊裊激動(dòng)地?fù)渖铣觯瑴I如泉涌。羞羞，羞羞……我以為你走了……再也不回來了……

不喜歡矯情的羞羞一爪子拍開他，眼角卻有透明的液體。

裊裊回到了這件屋子?；氐搅巳祟愂澜纭?/p>

她還是羞羞，不是裊裊。

生命森林的動(dòng)物們制定了很多的裊裊的浪子回歸路計(jì)劃。連貓媽都出動(dòng)了。

羞羞不為所動(dòng)依然淡定地在人類世界當(dāng)一條普通的白貓。

篇（6）

比如李嘉誠(chéng)在內(nèi)地保健品領(lǐng)域，就擁有不小的話語權(quán)。

羊胎素、有機(jī)奶粉、專供孕婦食用的 DHA產(chǎn)品，以及某些內(nèi)地學(xué)生逢大考前常常吃的保健品，都有李嘉誠(chéng)的產(chǎn)業(yè)。準(zhǔn)確地說，這些產(chǎn)業(yè)都?xì)w攏在和記黃埔旗下的和黃健寶保健品有限公司，這家公司成立已超過10年。

求醫(yī)問藥時(shí)，有些常用藥，比如板藍(lán)根顆粒、復(fù)方丹參片，也有李嘉誠(chéng)的影子。

和記黃埔旗下有專門的醫(yī)藥科技公司，在醫(yī)藥行業(yè)是不折不扣的“隱形大戶”，勢(shì)力覆蓋“北上廣”李嘉誠(chéng)在北京與同仁堂合作，在上海開辦有上海和黃醫(yī)藥有限公司，在廣州與白云山醫(yī)藥合資建廠。

2004年時(shí)，李嘉誠(chéng)明確定調(diào)：中藥將是和記黃埔的第六大支柱產(chǎn)業(yè)。緊跟著在2006年，李嘉誠(chéng)就將他的醫(yī)藥公司名單，掛上了歐洲的倫敦交易所，成了筆跨國(guó)大生意。 2011年5月20日，香港，李嘉誠(chéng)在公司股東會(huì)后出席新聞會(huì)。

另外一個(gè)巨頭雀巢公司就看中了李嘉誠(chéng)在中藥產(chǎn)業(yè)上的判斷，更看中李嘉誠(chéng)在中藥行業(yè)隱秘深耕多年的家底：和記黃埔的中藥材庫(kù)十分巨大，包括1200多種藥用植物的5萬種提取物。去年年底，雀巢第一次涉足中藥產(chǎn)業(yè)在此之前，這家瑞士公司也確實(shí)在嘗試做一些實(shí)驗(yàn)，比如在嬰兒米粉中加入綠豆和蓮子，讓產(chǎn)品能“去火”。

雀巢現(xiàn)在與李嘉誠(chéng)合伙開辦了一家公司，希望可以找到用中藥治療腸胃病的辦法。

總之，熱衷于進(jìn)入醫(yī)藥行業(yè)，這一點(diǎn)李嘉誠(chéng)與比爾·蓋茨的投資興趣很像。

除此之外，一個(gè)日化品牌白貓洗潔精，從2006年開始，就已經(jīng)是李嘉誠(chéng)的無形資產(chǎn)。2006年和記黃埔收購(gòu)了白貓集團(tuán)所持有的上海白貓有限公司80%的股份，共同組建上海和黃白貓有限公司，也就是“和黃白貓”。2009年4月，白貓集團(tuán)又將“白貓”商標(biāo)轉(zhuǎn)給和黃白貓，所以在市場(chǎng)上看到的“白貓”洗滌產(chǎn)品，已經(jīng)蓋上了李嘉誠(chéng)的烙印。

需要說明的是，“白貓”其實(shí)有兩個(gè)，另一個(gè)“白貓”是白貓股份，是一家經(jīng)營(yíng)不善的上市公司，2010年已退市。其間兩只“白貓”烏龍不斷，引得和記黃埔的新聞發(fā)言人要不時(shí)澄清：這只白貓和李嘉誠(chéng)沒關(guān)系。

李嘉誠(chéng)在另一個(gè)時(shí)髦領(lǐng)域互聯(lián)網(wǎng)、IT行業(yè)的投資令人感覺距離感更小。

他投過facebook、skype，以及后來被蘋果公司買走的語音助手軟件Siri。投facebook的決策時(shí)間只花了五分鐘，而當(dāng)時(shí)的facebook尚未營(yíng)收。五年間，他手中所持的3%股權(quán)，回報(bào)率高達(dá)580%，據(jù)估計(jì)，他能從中賺得20多億美元。李嘉誠(chéng)卻表示，在自己投資的新科技公司中，facebook賺得未必最多。

為他物色高科技企業(yè)的公司叫維港投資，專注于中早期科技類項(xiàng)目其操盤者正是五分鐘內(nèi)說服李投facebook的周凱旋。據(jù)《經(jīng)濟(jì)觀察報(bào)》報(bào)道，維港投資團(tuán)隊(duì)成員只有四名，一貫低調(diào)，沒有官方網(wǎng)站，卻能憑其遍布全球的團(tuán)隊(duì)，挖掘出一般人不易察覺的項(xiàng)目。

再往近了說，我們的“衣食住行”，也有“李嘉誠(chéng)牌。”華南地區(qū)能吃到的東北大米，會(huì)有一部分來自和記黃埔在黑龍江的生產(chǎn)基地。《證券時(shí)報(bào)》曾經(jīng)報(bào)道說，在中國(guó)入世前，李嘉誠(chéng)受邀到黑龍江投資稻米，并于1998年成立合資企業(yè)，開發(fā)近150萬平方公里產(chǎn)糧地。

篇（7）

2歲以前

女兒出生后幾天，從廣州天河區(qū)婦產(chǎn)醫(yī)院回家時(shí)，在家里歡迎她的就有一條司愛的長(zhǎng)毛小狗花花。花花頗有靈性，很快就明自了小寶寶在我們家中的地位，從來也不敢去碰一下孩子，只是不近不遠(yuǎn)地守著，而且非常盡職。女兒三四個(gè)月大的時(shí)候，似乎不會(huì)哭，她醒來時(shí)，沒什么聲響，我們不在房間，自然就感覺不到女兒醒來。這時(shí)，花花就會(huì)來扯我們的褲腿或鞋子，引我們?nèi)ズ⒆拥姆块g。女兒非常喜愛花花，只是后來給女兒看病的醫(yī)生數(shù)落我們不注意衛(wèi)生，我們才把花花關(guān)到了陽(yáng)臺(tái)上。可女兒還是每天要去陽(yáng)臺(tái)看一看花花，有時(shí)還要連去幾次。

女兒1周歲，我們到了重慶，住在郊區(qū)農(nóng)村的外婆家，又有了養(yǎng)狗的條件。一天，有個(gè)狗販子牽著幾條土狗到我們屋前，并介紹其中的一條特別兇，我卻偏要去摸一下那條狗。奇怪的是，它對(duì)我顯得特別溫順?？词怯芯?，我就把它留下了。這是我專門買給我女兒的第一條狗。狗販子叫它“小狗”，我們也叫它“小狗”。它礁實(shí)很兇，盡管有鐵鏈鎖著，也經(jīng)常要；中出去咬人。

女兒卻對(duì)它寵愛有加。所有，的好東西，都要拿去喂它。吃飯一定要和“小狗”分享，就連她拉出的屎也要留給它吃。平常女兒愛摸摸狗的耳朵、揪揪它的尾巴，后來還要騎到它的背上，那小狗總是俯首聽命的樣子，挨著小主人。但它對(duì)陌生的路人，仍然是那么兇。有一回，一個(gè)路人經(jīng)過，我女兒命令它：“沖，”它真的吼著沖了出去，雖有鏈子拴著，也著實(shí)把路人嚇了一跳。后來我才明白：它那么兇，是因?yàn)樗褢延凶凶?，懷仔的母狗是要比平時(shí)更兇一些。不久，“小狗”就生了兩個(gè)仔仔公的叫阿旺，母的叫阿彩，這可把我女兒樂壞了。她經(jīng)常提著、抱著兩只小狗，有時(shí)還抱到我們睡覺的床上去，屢禁不止?？粗龑?duì)小動(dòng)物的那種深愛，我時(shí)常不顧妻子的反對(duì)，網(wǎng)開一面，由著她在床上同小狗嬉戲。孩子與小動(dòng)物一起玩，能自然地表現(xiàn)她內(nèi)心的愛，也能通過與動(dòng)物的接觸，了解動(dòng)物。動(dòng)物世界恐怕是幼兒對(duì)外界感知最樂意探究的一個(gè)世界了。

除了“小狗”，我還先后給女兒買了一只白貓和一只花描。那只白貓看起來就挺可愛，只是冬天老要跳到我們床上來睡覺。揮之不去，簡(jiǎn)直無奈它何。而且，不見它捉老鼠；捉老鼠的事情是由“小狗”代庖的?？墒俏遗畠簠s非常喜歡它。后來，那只白貓出去就再也沒有回來。我女兒很傷心，在給幾十公里外的我打電話時(shí)，首先告訴我的就是白貓的事。為了安撫女兒，我又買回一只花描?？墒遣痪?，花貓誤食老鼠藥而死了。我女兒又不免傷心一陣。后來，我們一家三口搬到重慶市里去住，就無法養(yǎng)狗養(yǎng)貓了。但是，我們會(huì)天天帶女兒去重慶的市府廣場(chǎng)，吃過晚飯后，那里有很多出來溜狗的，各種各樣的狗，應(yīng)有盡有?？吹矫織l拘，女兒都要去逗逗。而且，廣場(chǎng)的一角還養(yǎng)著一群鴿子，女兒非常喜愛在那里喂鴿了。

2歲隊(duì)后

從重慶經(jīng)上海再到浙江的海鹽后，我們又有了養(yǎng)小動(dòng)物的空間。最多的時(shí)候，我家有一只小狗、一只小貓和各種鳥(十幾只)，一大堆小動(dòng)物，非常熱鬧。這時(shí)候，女兒玩著動(dòng)物已學(xué)會(huì)了不少有關(guān)動(dòng)物的英語單詞 和短句子。漸漸地，女兒對(duì)貓咪情有獨(dú)鐘。

女兒自號(hào)Sister Cat，模仿貓的動(dòng)作、神態(tài)，每天要督促我們別忘了給貓咪買小魚。最有趣的是，女兒看了一部描寫外國(guó)科學(xué)家飼養(yǎng)動(dòng)物，并進(jìn)行研究的片子，看到他們用英語與動(dòng)物溝通，她就認(rèn)為動(dòng)物能聽懂英語，而聽不懂中文。所以，她時(shí)常會(huì)與她可愛的貓咪說一大堆英語。她還給這只貓咪起了個(gè)英語名字：Angel(天使)。我問她為什么起這個(gè)名字?她說：“我的名字是Angella，我是她姐姐，我的妹妹就應(yīng)該叫Angel?！甭犉饋磉€頗有道理。

對(duì)小動(dòng)物的喜愛，也帶動(dòng)了女兒的學(xué)習(xí)。比如全神貫注地觀看有關(guān)動(dòng)物的動(dòng)畫片；學(xué)畫動(dòng)物；不厭其煩地反復(fù)學(xué)習(xí)有關(guān)動(dòng)物的中外文字，她第一個(gè)脫口而出的日語就是neko(貓)！乃至教她的《詠蛙》詩(shī)，她也學(xué)得津津有味，讀幾遍即能成誦。更沒想到，過一些天，女兒還根據(jù)的《詠蛙》，改出了她的《詠貓》詩(shī)。

《詠蛙》

／1909年

獨(dú)坐池塘如虎踞，

綠蔭樹下養(yǎng)精神。

春來我不先開口，

哪個(gè)蟲兒敢作聲?

《詠貓》

女兒的改作／2004年12月

獨(dú)坐客廳如虎踞，

桌子底下養(yǎng)精神。

篇（8）

話劇開始了，出現(xiàn)了獨(dú)眼狼、單眼狼，他們被關(guān)進(jìn)大牢里，外面有很多士兵守衛(wèi)。就在這個(gè)時(shí)候，臭狐貍代表大灰狼來看他們。它手里拿著一盒曲奇餅干，說：“我特意代表大灰狼來看你們了，這盒餅干是我們的一點(diǎn)心意。當(dāng)年大灰狼和你們一起坐牢，可是被一場(chǎng)海嘯分開了，這次我們找到了你們，特意送來餅干，表示一點(diǎn)心意……”

狐貍走了，衛(wèi)兵也走了。獨(dú)眼狼和單眼狼食偷偷地把曲奇餅干盒打開，他們發(fā)現(xiàn)盒子里面有一個(gè)紙條和一把萬能鑰匙，他們說：“這一定是大狼給我們的。”然后他們說，這兩天一定會(huì)來一場(chǎng)大大的雷陣雨，所以要它們趁雷陣雨和霧氣很大時(shí)把門偷偷打開，逃出去。

當(dāng)然，這個(gè)計(jì)劃成功了。半路上，突然聽到黑貓警長(zhǎng)的聲音，他們拼命的逃，逃到了一家超市店門口，因?yàn)榻裉煊欣子?，超市提前關(guān)門。他們突然想起自己手中有一把萬能鑰匙，他們就用萬能鑰匙把門打開，進(jìn)入超市偷走了很多東西，把肚子也填飽飽的了。

可當(dāng)出來的時(shí)候，發(fā)現(xiàn)黑貓警長(zhǎng)把他們包圍了。這時(shí)，大狼和狐貍從四周殺來救他們，于時(shí)他們沖出了包圍。壞蛋們一起逃啊逃啊，突然發(fā)現(xiàn)黑貓警長(zhǎng)在前面攔住了他們，白貓警長(zhǎng)和小鹿警官在后面攔住了他們，使他們無路可逃，又被關(guān)進(jìn)了大牢。

篇（9）

這三節(jié)課的共同點(diǎn)是：

一、基本上都落實(shí)了學(xué)講計(jì)劃的精神，先學(xué)后教，給足了學(xué)生自主學(xué)習(xí)的時(shí)間，整個(gè)教學(xué)過程中滲透了學(xué)生的自學(xué)、互學(xué)，教學(xué)的痕跡。突出了學(xué)生的主體地位，教師退到了后面，給足了學(xué)生充分展示自己的機(jī)會(huì)，教師主要發(fā)揮四兩撥千斤的作用。

二、課堂教學(xué)有重點(diǎn)突出，教師對(duì)于教材的解讀深刻，有新意，教學(xué)程序設(shè)計(jì)巧妙，環(huán)環(huán)相扣，條理清晰。教學(xué)過程中，重視對(duì)學(xué)生的朗讀訓(xùn)練，形式多樣，教師指導(dǎo)到位。

三、教師教態(tài)自然大方，在上課前都注重課堂管理，采用交談，夸贊、鼓勵(lì)性的話語拉近與學(xué)生的距離，讓學(xué)生入情入境，充分調(diào)動(dòng)學(xué)生的學(xué)習(xí)積極性，課堂氣氛活躍。在教學(xué)過程中，教師語言親切柔和，對(duì)學(xué)生的表現(xiàn)，評(píng)價(jià)及時(shí)中肯。

這三節(jié)課體現(xiàn)了三種不同的風(fēng)格：

第一節(jié)宋穎老師執(zhí)教的《桂花雨》，就如宋老師給人的春風(fēng)化雨般的感覺一樣，溫柔舒適，親切柔和，真有如沐春風(fēng)般的感覺。尤其是指導(dǎo)朗讀很有特色，善于創(chuàng)設(shè)情景讓學(xué)生入情入境。在指導(dǎo)朗讀贊美桂花之香時(shí)，創(chuàng)設(shè)了四種情景讓學(xué)生讀，當(dāng)桂花落在額頭、鼻尖、衣袖、全身不同的情況下對(duì)桂花的贊美。再如理解"纏"時(shí)，又創(chuàng)設(shè)了一天之內(nèi)的不同時(shí)間"纏"著媽媽問啥時(shí)搖桂花的情景，讓學(xué)生朗讀體會(huì)。最動(dòng)情的地方是配樂朗讀和電影般的情景再現(xiàn)似回讀。宋老師選的配樂曲溫婉動(dòng)聽，聽了確實(shí)令人動(dòng)情，加之宋老師高超的朗誦水平，確實(shí)讓學(xué)生直接的感受到了懷念故鄉(xiāng)之情。宋老師還聯(lián)系了最后一句中懷念兒時(shí)搖桂花的情景，運(yùn)用配樂的方式回讀文章的第三節(jié)搖桂花的句子，再現(xiàn)了這一情景，真如電影回放一樣，聽這節(jié)課令人很感動(dòng)。

篇（10）

小編大話:不由聯(lián)想起大話西游的孫悟空面對(duì)紫霞時(shí),動(dòng)心則傷身,世間最痛苦之事莫過于此。

最聰明白貓:不愛吃魚專吃草

一只大白貓先是撥弄著一堆枯草,從枯草中尋找起青草的根部來。過了老大一會(huì)后,它把頭伸進(jìn)枯草里聞,在草堆里咬起其中的幾根嫩青草來,并津津有味地嚼起來。然而,令人意想不到的是,過了一會(huì)兒,在吃了多根青草后,這只小貓突然竄至路邊一小轎車旁,在一處隱蔽的地方嘔吐了起來,隨后,它聰明地用爪子扒起土塊,把嘔吐物蓋上才離開現(xiàn)場(chǎng)。

貓的主人朱先生稱,小白貓名叫小白,至今年也才養(yǎng)了兩年時(shí)間。平時(shí)它喜愛吃魚,還有一些其它的肉食,有時(shí)喂蘋果給它吃,但它聞都不聞。有時(shí)碰到素食,是寧可餓肚子也不吃,十分地倔強(qiáng),還會(huì)“喵喵”地大叫,以示抗議。最近幾天,朱先生才發(fā)現(xiàn)小白對(duì)青草如此好奇,有時(shí)還品嘗。也是偶然之間,他發(fā)現(xiàn)貓有嘔吐現(xiàn)象。

寵物專家稱,可能這只白貓患了胃病,通過吃草來治療。據(jù)其介紹,動(dòng)物有一種天性,就像人類生了病,也能找到某種草藥可以治愈一樣。比如,當(dāng)白貓的肚里有寄生蟲或是患上消化道疾病時(shí),往往就會(huì)發(fā)生胡亂吞草的情形,以此來達(dá)到催吐之效,從而把令其身體不適的東西吐出來。

小編大話:貓中“神農(nóng)”驚現(xiàn)世間,不靠獸醫(yī)能自診。

最星范兒動(dòng)物:修煉成精的牧羊犬

現(xiàn)年10歲的英格蘭牧羊犬“藍(lán)色”自從6個(gè)月時(shí)便跟隨主人模仿臺(tái)球動(dòng)作,如今竟無師自通地學(xué)會(huì)了打臺(tái)球。由于球技高超,他已經(jīng)成了遠(yuǎn)近聞名的“臺(tái)球神犬”?！八{(lán)色”是一條博德牧羊犬,它的主人介紹,“藍(lán)色”對(duì)臺(tái)球懷有天然的興趣。每當(dāng)主人在酒吧舉桿打球時(shí),“藍(lán)色”便會(huì)聚精會(huì)神地在一旁觀察。隨著個(gè)頭的長(zhǎng)大,“藍(lán)色”無師自通地學(xué)會(huì)了打臺(tái)球。它總是用兩條后腿站立,抬起兩條前腿伏在球案邊上認(rèn)真瞄準(zhǔn),最后用前爪猛地撞擊一下主人事先為它架好的球桿。每當(dāng)彩球應(yīng)聲落袋,“藍(lán)色”都會(huì)興奮地圍著球桌跑幾圈。

小編大話:如今寵物們可不甘心單調(diào)的生活,他們也能大膽秀自己。

最佳和平獎(jiǎng):海豚與老虎惺惺相惜見面吐泡泡問好

在自然界,海豚和老虎幾乎難以相遇。不過,在美國(guó)加利福尼亞六旗探索王國(guó)游樂園,一只寬吻海豚(bottlenose)竟然和一只孟加拉老虎結(jié)為了好友,在相見"小虎妹" 時(shí)還會(huì)以吐泡泡的獨(dú)特方式問好。

這只名叫馬利克的寬吻海豚似乎對(duì)孟加拉虎崽阿卡薩心存好感。每當(dāng)這只孟加拉幼虎靠近玻璃水缸時(shí),海豚馬利克便會(huì)主動(dòng)翹起頭游到它跟前,并還會(huì)轉(zhuǎn)過身子讓它慢慢欣賞。

據(jù)了解,孟加拉雌性幼虎阿卡薩只有6個(gè)月大,而馬利克則已有1年2個(gè)月大。據(jù)六旗探索王國(guó)游樂園(Six Flags Discovery Kingdom)的工作人員透露,"小虎妹"阿卡薩是在被飼養(yǎng)員帶領(lǐng)散步時(shí)結(jié)識(shí)到了這位海豚好友。

小編大話:21世紀(jì)什么最重要?和諧嘛!

最怕冷少年:體溫僅30℃

英國(guó)柴郡沃林頓市的14歲男孩本?布朗患有一種罕見的“下丘腦綜合征”,這一怪病導(dǎo)致他的身體體溫總是比常人的正常體溫低7℃。只有30℃體溫的他成了世界上“最怕冷的少年”,即使在烈日炎炎的大熱天里,他也必須穿著厚厚的冬裝,戴著羊毛帽,圍著羊毛圍巾,把自己裹得嚴(yán)嚴(yán)實(shí)實(shí)。稍不注意,他隨時(shí)都可能陷入昏迷,引發(fā)生命危險(xiǎn)。

布朗笑著說:“我的朋友們也希望體驗(yàn)一下我的疾病―――僅僅體驗(yàn)一次。不過老實(shí)說,我的疾病非常讓人煩惱,我必須萬分小心。如果我感到體溫下降,我必須立即躺進(jìn)浴缸中洗熱水澡,并立即將自己裹得密不透風(fēng)。不過,你不應(yīng)該讓這種事影響你的生活,你必須在生活中保持微笑?！?/p>

小編大話:小本?布朗應(yīng)該搬到蘇丹去,那是最適合他的地方。

最長(zhǎng)的舌頭:美長(zhǎng)舌男用舌頭舔眼睛發(fā)短信

美國(guó)加州20歲男孩尼克?阿法納西耶夫號(hào)稱擁有全美最長(zhǎng)的舌頭,他可以輕松地用舌頭舔到自己的眼睛,還能用舌頭來發(fā)短信,相當(dāng)神奇。

靠著自己的這項(xiàng)特長(zhǎng),尼克上遍所有的電視節(jié)目做宣傳。在一次直播中,女主播忍不住好奇,用尺子對(duì)尼克的舌頭進(jìn)行了測(cè)量。測(cè)量結(jié)果顯示,舌頭長(zhǎng)9厘米,接近世界紀(jì)錄了。

尼克的另一項(xiàng)絕活是用舌頭發(fā)短信,他用舌頭在手機(jī)上寫字,然后熟練地發(fā)出一條信息。他開玩笑說:“開車手沒空時(shí),舌頭就可以發(fā)短信?！?/p>

目前,他靠著長(zhǎng)舌拍了50多部影片,《變形金剛3》劇組也邀請(qǐng)他演出。

小編大話:但愿他的舌頭不要再生長(zhǎng)了,否則他的嘴巴容不下,將來不得不像獵犬一樣將舌頭從嘴巴中耷拉出來。

最震撼的服務(wù):超級(jí)接客時(shí)地動(dòng)山搖

日前,德國(guó)一名被鄰居告上法庭。原因不是非法,而是她接客時(shí)動(dòng)靜太大,常常讓鄰居們感覺“地動(dòng)山搖”。

這位名叫伊爾內(nèi)斯?洛爾巴赫,體重竟達(dá)230斤。她的鄰居卡洛爾索?霍夫曼抱怨稱:“我感覺就像身處電影《大地震》中的情景。不知道是不是她或者她的客人讓大地都震了起來,但我們確實(shí)感覺到震動(dòng)?！辈贿^,洛爾巴赫也有讓人同情的一面――她是一位單身母親。目前,她正計(jì)劃讓自己的“工作”合法化,希望能在德國(guó)拿到許可,然后用自己的房子開一家小型妓院。

洛爾巴赫的鄰居霍夫曼在接受《太陽(yáng)報(bào)》的采訪時(shí)說:“每當(dāng)她接客的時(shí)候,我家里書架上的水晶飾品就會(huì)掉下來,墻上的畫也會(huì)散落得到處都是。與此同時(shí),洛爾巴赫也對(duì)鄰居們充滿歉意。上周,由于她的“過失”,鄰居家的一對(duì)名貴的杯子被打壞。據(jù)稱,每個(gè)杯子都價(jià)值100英鎊。

36歲的洛爾巴赫在接受采訪時(shí)說:“一個(gè)單身母親靠這種方式糊口確實(shí)很難,但我努力讓自己變得勤勞,讓不可能變成可能?！蹦壳?距離法庭的宣判還有一段時(shí)間,同樣身為女性的法官尚未決定該如何判決。

小編大話:還是勤勞致富吧!

最潮新品:解放鞋大變身受追捧

你家還有老底子的解放鞋嗎?有的話,趕緊擦擦灰,穿起來。如今,日本最新潮品就是解放鞋,而且改良版的解放鞋在歐美成時(shí)尚寵兒,身價(jià)堪比耐克。

千萬別詫異,這種早就被國(guó)人遺棄的布鞋,搖身一變已成了時(shí)尚新寵兒。在美國(guó),一雙改良過的解放鞋甚至賣到了65美元,跟國(guó)際知名品牌NIKE同等價(jià)位?！本W(wǎng)友們的議論也很熱烈:有的說下次出國(guó)要批發(fā)一堆解放鞋帶出去;還有的說,如果我手挽一只LV的編絲袋、腳蹬一雙綠色解放鞋,那我就是最時(shí)尚的人了!

小編大話:中國(guó)元素越來越多的展現(xiàn)在世界面前,被時(shí)尚人士追捧。

最捉弄人的軟件:“測(cè)出你有多丑” 隨機(jī)送毒舌評(píng)語

當(dāng)一款軟件智能到可以評(píng)論一個(gè)人的長(zhǎng)相時(shí),人們就會(huì)大呼過癮了,但當(dāng)它還隨機(jī)附送毒舌評(píng)語時(shí),被評(píng)丑的人就不得不捶胸頓足了。

據(jù)悉,一款在iPhone上使用的名為“丑臉評(píng)分表”(UglyMeter)的應(yīng)用程序面世,聲稱可以“測(cè)出你有多丑”。只要拿著iPhone對(duì)著人臉或照片進(jìn)行拍攝,這款軟件就會(huì)實(shí)時(shí)分析照片中人的面部輪廓,并給出一個(gè)分?jǐn)?shù),分?jǐn)?shù)越高,說明長(zhǎng)相越“丑”,其中最高分為10分。最有趣的是,這款軟件還能隨機(jī)給出毒舌評(píng)語,令人捧腹。

有好事者用“丑臉評(píng)分表”給幾位家喻戶曉的“明星臉”打分。中國(guó)臺(tái)灣名模林志玲最討此軟件歡心。林志玲被評(píng)為1.2分級(jí)的超級(jí)美女。緊隨其后的好萊塢影星安吉麗娜?朱莉得分只有2分,如此低的分?jǐn)?shù)說明“美女是經(jīng)得起各種考驗(yàn)的”。

小編大話:這可是最整蠱人的玩意了,即使機(jī)器和人類的審美觀有差異,但機(jī)器是不會(huì)撒謊的。